大鼠耐苯妥英钠和苯巴比妥钠杏仁核点燃模型及多药耐受基因的表达

1、    大鼠耐苯妥英钠和苯巴比妥钠杏仁核 点燃模型及多药耐受基因的表达        【摘要】目的探索耐苯妥英钠和苯巴比妥钠（PHT-PB）杏仁核点燃大鼠模型的建立并评价其可靠性。方法采用苯妥英钠（PHT）、苯巴比妥钠（PB）对 40只杏仁核点燃大鼠进行筛选，按照国际通用标准，根据后放电阈值（after discharge threshold, ADT ）的变化判断点燃大鼠对 PHT和PB的敏感性，并测定大鼠脑部P-糖蛋白（P-glycoprotein, PGP）的

2、表达,证实耐药的客观性。结果点燃鼠对PHT、PB具有不同程度的敏感性，6只点燃大鼠对PHT、PB不敏感；6只点燃大鼠PHT、PB能显著增高其 ADT。耐药组鼠大脑广泛脑区的PGP表达较药物有效组显著增强。结论用PHT、PB对点燃大鼠进行筛选以制备耐 PHT-PB点燃模型的方法是可行的；可利用其建立难治性癫痫模型，进行耐药机制的探讨。【关键词】疾病模型，动物抗惊厥药 抗药性，多药 Development of PHT-PB-resistant amygdala-kindled rats and expression of MDR1XIAO Zheng, YAN Yong, WANG Xuefen

3、g. Department of Neurology,The First Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016【Abstract】ObjectiveTo study the method of development of PHT-PB-resistant amygdala-kindled rats. MethodsBy examining the effects of the antiepileptic drugs PHT and PB in a group of rap

4、idly kindled rats,the 40 animals with different sensitivity to these drugs were selected. Then using immunohistochemistry method to determinate the expression of PGP in the brain of the rats. ResultsUsing determination of the after discharge threshold for evaluation of PHTs and PBs anticonvulsant ef

5、fects, 6 animals showed no increase in their ADT at repeated test trials with PHT or PB (from PHT-PB-resistant rats), and 6 animals exhibited reproducible increase in ADT about 100% after injection of PHT or PB (from PHT-PB-nonresistant rats). The immunohisto-chemistry for P-glycoprotein showed incr

6、eased staining in capillary endothelium in the samples from PHT-PB-resistant rats as compared with staining in PHT-PB-nonresistant rats,in extensive fields of bilateral cerebral hemispheres (P<0.05). ConclusionThe procedure,using PHT, PB to screening kindling models to make PHT-PB-resistant amygd

7、ala-kindled rats, would be reliable .Overexpression of PGP in PHT-PB-resistant rats would suggest that the kindled rats with PHT-PB resistance could serve as reliable models of drug resistant epilepsy.The kindled rats with PHT-PB resistance might be a resource for the investigation of the mechanisms

8、 for drug resistance in epilepsy. 【Key words】Disease model, animalAntconvulsantsDrug resistance, multiple 难治性癫痫是目前尚未攻克、但急需解决的问题。难治的原因除成因复杂外，还与对其发作机制不了解，不能根据发作的关键环节开发新药物、寻求新的治疗途径有关。癫痫病人脑组织取材困难，即使获取标本，在离体脑组织上模拟发作的真实情况也极为困难。因而建立难治性癫痫模型，在实验条件下研究其耐药机制是临床医学摆脱目前治疗被动局面的有效途径。为此，我们利用杏仁核快速点燃大鼠模型，用PHT、PB进行耐药筛选，

9、测定耐药组与有效组大鼠脑部 PGP表达情况，多角度探讨耐药性癫痫模型的建立，评价其可靠性。现报道如下。材料与方法一、材料1.动物：68周龄雄性Wistar大鼠40只（重庆医科大学实验动物中心提供），体重250300 g，分隔喂养，随机提取。点燃后进行药物筛选，根据其对药物的不同反应分为耐药组和有效组，并测定其脑部PGP的表达。2.器材：二道生理记录仪（LMS-2B型，成都仪器厂）， IS-2型智能刺激器及XCG-1型光偶线性刺激隔离器（中国科学院上海生理研究所），动物大脑定位仪（DGY-79A型，长春锻压设备厂），C219单克隆抗体（日本Centocor公司），即用型链霉素抗生物素蛋白-过氧化

10、酶免疫组化染色超敏试剂盒（SABC，武汉博士德公司），螺旋式双极漆包镍铬电极（直径0.10 mm，尖距0.02 mm），牙科水泥，连接器。二、方法1.刺激参数：频率16 Hz，波宽1毫秒，串长10毫秒，刺激间隔时间7分钟，点燃刺激强度0.4 mA。电流具有恒流、方波特性。2.电极埋植与固定：2%戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/kg体重），分批麻醉40只大鼠，固定于脑立体定位仪，将双极漆包镍铬电极植于右侧杏仁基底外侧核（坐标定位：前囟后1.0 mm，旁开5.3 mm，颅骨表面下8.5 mm，门齿高于耳杆平面5.0 mm），钟表螺钉固定于额窦上作为接地电极。所有电极引入连接器，并用牙科水泥固定于颅

11、顶。3.杏仁核快速点燃：术后7天，刺激强度从20 A起步，每次递增20 A，刺激间隔1分钟，直至出现后放电，此时电流强度即为点燃前ADT；5分钟后，以0.4 mA的电流强度反复刺激动物杏仁核直至出现Racine级行为，即点燃(癫痫大发作)；点燃动物连续出现10次强直-阵挛发作后24小时，以同样方法测定点燃后ADT。4.药物筛选：确定点燃后，在ADT 24小时后进行药物筛选实验。动物腹腔内注射PHT（75 mg/kg体重，已证实该剂量在用药后1小时可以增高ADT1,2），给药后1小时测定用药后ADT，同步取血用高效液相色谱仪测定药物浓度并观察药物副反应。每只动物每周给药1次，共重复3次。1周后腹

12、腔注射 PB（30 mg/kg体重)1,2，重复上述步骤。对照ADT在给药前24小时腹腔注射等体积生理盐水后1小时测定。5. PGP的测定：大鼠断头取脑，制成冰冻切片，纯丙酮固定10分钟，0.03% H2O2中孵育5分钟；PBS液冲洗，切片组织滴加10%正常山羊血清，室温孵育10分钟；去除血清。切片组织以C219单抗（1150）37孵育1小时；PBS漂洗，滴加生物素化山羊抗小鼠/兔IgG， 37孵育30分钟；PBS漂洗，滴加SABC试剂，37孵育30分钟；PBS漂洗，以二氨基联苯胺显色，常规苏木精复染，脱水透明封固。主要观察小脑、额叶、颞叶、顶叶及杏仁核区域。用测微格技术进行计数，单位:细胞数

13、/每平方毫米（cells/mm2）。6.疗效判断：据Loscher等3报道和预试验结果显示，ADT有20%变异范围，故PHT-PB有效鼠标准为：与对照ADT相比,每次用药后ADT增高100%的大鼠；耐PHT-PB点燃鼠标准与对照ADT相比，每次用药后ADT不增高或仅增高20%的大鼠。7.统计处理：数据以±s表示，用OXSTAT医学统计软件，进行两样本均数比较t检验、配对t检验和2检验。结果40只大鼠中，点燃31只，成功率为78%。点燃的31只鼠中，21只动物通过PHT 3次药物筛选：6只动物3次PHT试验中ADT不增高或仅增高20%；7只动物每次用药后ADT增高100%以上；另有8只

14、大鼠3次用药后ADT变化不定。上述21只动物1周后再以PB进行筛选， PB 3次药物筛选均全部通过：7只动物3次PB试验中ADT不增高或仅增高20%；7只动物每次用药后ADT增高100%以上；另有7只大鼠3次用药后ADT变化不定。将6次 PHT、PB试验结合起来，共有6只动物6次PHT、PB试验ADT不增高或仅增高20%，归入耐药组，耐药率为29%；6只动物6次用药后ADT增高100%以上，归入药物有效组，有效率29%；另有9只大鼠6次用药后ADT变化不定，未纳入进一步分析与试验。耐药组、有效组点燃前后ADT变化见表1。点燃前，耐药组ADT显著高于有效组（P<0.05），点燃后，两组AD

15、T比较，差异无显著意义（P>0.05）；耐药组及有效组点燃前后ADT比较，差异均无显著意义（P>0.05）。表1耐药组和有效组点燃前后ADT比较（±s，A）组别 鼠数 点燃前ADT 点燃后ADT耐药组6218±46 160±28有效组6 123±38*145±55 * 与耐药组比较， P<0.05 部分动物用药半小时后有不同程度的副反应如共济失调、站立不能等，但耐药组与有效组比较差异无显著意义（P>0.05）。血药浓度均在有效范围内，耐药组与有效组间比较差异无显著意义（P>0.05）。测定5只耐药鼠与6只有效鼠脑部

16、PGP表达情况：耐药组杏仁核、额叶、颞叶、顶叶PGP表达较有效组显著增多（表2）；耐药组动物的毛细血管内皮细胞有大量PGP表达，有较多星形胶质细胞 PGP表达阳性；有效组仅见少量毛细血管内皮细胞有PGP表达，星形胶质细胞罕见PGP表达（P<0.05）， 见1、2。小脑PGP阳性表达见于毛细血管内皮细胞、颗粒细胞，两组比较差异无显著意义（P>0.05）。表2耐药组和有效组不同脑区PGP表达(±s，cells/mm2)组别 鼠数杏仁核额叶颞叶顶叶小脑耐药组5209±24122±3089±3110±770±13有效组615

17、77;11*9±8*0±0*0±0*69±28注：与耐药组比较，*P<0.001，*P<0.05；实验过程中，耐药组1只动物意外死亡1耐药组杏仁核区域大量毛细血管内皮细胞PGP表达阳性, 较多星形胶质细胞PGP表达阳性。SABC免疫组化法×1002有效组杏仁核区域少量毛细血管内皮细胞PGP表达阳性, 罕见星形胶质细胞PGP表达阳性。SABC免疫组化法×100讨论常用抗癫痫药并不针对疾病的病因。原发性或由多种原因所致的继发性癫痫，甚至由颅内肿瘤这样有明确病因、需手术处理的疾病，常用抗癫痫药也有不同程度控制发作的作用。难治性癫

18、痫最突出的特征就是对有不同化学结构、不同作用机制的3种以上一线抗癫痫药有明显的耐药性。目前，在动物实验中判断这种耐药性公认最敏感、可靠的指标是ADT4。本实验据此判断动物对药物的敏感性，筛选出耐药鼠与有效鼠，耐药组诱发ADT的阈值在用药后无明显变化，提示PHT-PB没有改变癫痫发作的阈值；有效组诱发ADT的阈值在用药后明显提高，支持前者对 PHT-PB有耐药性。对两组动物点燃前后的ADT进行比较，发现点燃前耐药组ADT明显高于有效组（P<0.05），点燃后两组间 ADT比较，差异无显著意义（P>0.05），点燃前后ADT比较，两组均无显著变化（P>0.05），提示耐药鼠的癫痫

19、易感性比有效鼠相对较低，但点燃后其癫痫易患性似与有效鼠无明显差异，因而不影响结果的判断。癫痫病人的耐药性是客观存在的。我们曾在血药浓度监测条件下，对510例癫痫病人进行一线抗癫痫药耐药性研究，发现其耐药性为 10%20%，并有交叉耐药性5，6。本实验将临床最常用的PHT和PB作为试验药物，发现Wistar大鼠耐药的发生率为29%，两种药物之间有交叉耐受性，这与人类耐药现象非常相似。本实验的结果还受到Loscher等研究结果的支持。Loscher等1曾用 52只点燃鼠反复评价 PHT的急性抗癫痫效应，发现有20%的点燃鼠耐药，同时指出点燃鼠对PHT的不同反应不是电极埋植部位差异、药动学差异及药效

20、学遗传差异所引起，而是动物个体差异所致。以后的研究还发现，对PHT耐药的点燃鼠对其他抗癫痫药如PB、丙戊酸以及新药氨已烯酸都有相似的耐药性，说明这种耐PHT的点燃模型可能是进行耐药机制研究的唯一途径1-4。本实验建立的模型具有：(1)发作类型与临床中的耐药类型类似（临床中常见耐药类型包括复杂部分性和部分性癫痫发作）；(2)模型发作时有脑部阵发性异常放电，可供从电生理角度评价药物疗效；(3)常规抗癫痫药不能满意控制发作；(4) 能提供抗癫痫药效能的长期研究（即发作后动物可存活，慢性用药后可维持有效血药浓度）特征，完全符合国际学术界难治性癫痫模型的要求4。故本实验建立的动物模型是目前进行耐药性研究

21、的一个较为理想的动物模型。在对癫痫病人耐药性研究中有人发现，国内癫痫病人的耐药性主要有3种：先天、功能性和代谢性耐受5，6。本实验评价的是PHT-PB的急性抗癫痫效应，因而其耐药性应主要与先天性和功能性耐受有关。PHT、PB、卡马西平及丙戊酸的化学结构、作用机制完全不同，但难治性癫痫病人或耐药性癫痫鼠对此都有不同程度的耐药性，提示可能有一种共同的耐药机制在起作用。1970年Biedler等首次提出多药耐受（multidrug resistance,MDR)的概念。以后的研究发现，人类MDR基因族主要由MDR1、MDR3组成，前者起主导作用，其表型标志是一种相对分子质量为170 000的胞膜糖蛋

22、白，称为P-糖蛋白（PGP），其功能为能量依赖的跨膜外排泵，其活动增加可致细胞内药物浓度降低，对不同的亲脂类药物产生交叉耐药性7。 PHT、PB及卡马西平等抗癫痫药物化学结构各异，但均与PGP药物外排泵的底物结构一致8，因而患者或大鼠对PHT、PB的耐药可能与此有关。本实验中我们采用免疫组化方法，用C219单抗测定了耐药组、有效组点燃鼠脑组织中PGP表达情况，发现所测区域除小脑外，杏仁核、额叶、颞叶及顶叶等脑区的PGP表达两组间存在显著差异；耐药组动物大脑广泛区域的 PGP表达明显增强，除毛细血管内皮有大量PGP阳性表达外，多数星形胶质细胞PGP表达也呈阳性；有效组中仅少量毛细血管内皮 PGP

23、呈阳性表达，星形胶质细胞罕见PGP表达。耐药鼠大脑广泛区域 PGP表达与ADT的变化呈现高度一致性，支持本实验模型具有耐药特征。同时也表明，PGP的药物泵出功能可能是癫痫病人耐药的重要机制。这种耐药不仅表现为病灶部位的耐药，而且是大脑广泛脑区的耐药。因而PGP表达增强可以作为癫痫大鼠或癫痫病人耐药的标志。作者单位：重庆医科大学附属第一医院神经内科400016参考文献1Loscher W, Rundfeldt C. Kindling as a model of drug-resistant partial epilepsy:selection of phenytoin-resistant and nonresistant rats. J Pharmacol Exp Ther, 1991,258:483-489.2Loscher W,Fassbender CP,Gram L, et al. Determination of GABA and vigabatrin in human plasma by a rapid and simple HPLC method:correlation between clinical response to vigabatrin and increase in plasma GABA. Epilepsy Res, 1993,14:245-255.3