吡格列酮对大鼠痛风性关节炎滑膜细胞因子表达的作用

1、吡格列酮对大鼠痛风性关节炎滑膜细胞因子表达的作用l24TianjinMedJ,Feb2007,Vol35No2吡格列酮对大鼠痛风性关节炎滑膜细胞因子表达的作用黄火高王兆君张彦彬施海燕韩春光刘永学摘要目的:研究过氧化物酶体增殖物激活受体/(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma,PPAR/)激动剂吡格列酮.对大鼠急性痛风性关节炎滑膜表达细胞因子的调控作用,探讨其作用机制.方法:大鼠单侧踝关节注射人工尿酸钠晶体制作急性痛风性关节炎模型,于注射48h后取关节滑膜,以RTPCR法检测吡格列酮(2Omg?kg?d.)口服给药对滑膜表达肿瘤坏死因子ct(

2、TNFd),白介素1B(IL_1B),白介素1受体拮抗剂(ILIRa),细胞因子诱导中性粒细胞化学趋化因子(CINC,相当于人的白介素8),干扰素T(IFN一)和白介素4(IL-4)的作用.结果:吡格列酮用药组滑膜表达TNFd,CINC和IFN显着低于对照组,抑制率分别为81.7%,90.9%,65_3%;IL一4表达高于对照组,增加率为340.O%;IFN一L-4比值显着低于对照组,抑制率为92.6%.2组IL-I和IL-1Ra的表达差别无统计学意义.结论:吡格列酮对急性痛风性关节炎的抗炎作用与抑制TNFd和CINC的表达.并促使Thl/Th2平衡向Th2为优势转化有关.关键词过氧化物酶体增

3、殖物激活受体噻唑烷二酮类痛风细胞因子类大鼠EffectsofPioglitazoneonCytokineExpressionsinSynoviuminRatswithAcuteGoutyArthritisHUANGHuogao,WANGZhaojun,ZHANGYanbin,SHIHaiyan,HANChunguang,LIUYongxueDepartmentofEndocrinologyandRheumatology,NavyGeneralHospitalofPLA,Beijing100037,ChinaAbstractObjective:Toinvestigatetheeffectsofp

4、emxisomepmliferatoractivatedreceptorgamma(PPART)agonist,pioglitazone.oncytokineexpressionsinsynoviuminratswitIlacutegoutyarthritisinducedbymonosodiumuratemonohydrateStO.Methods:ModelofacutegoutyarthritisWaSinducedwiththeinjectionof1mgofMSUintorats'anklejointcavity.Fortyeighthoursafterinjection,c

5、ytokinemRNAexpressionsincludingTNF-or,IL-I,ILIRa,CINC(cytokineinducedneutrophilchemoattractant,equivalenttoIL一8),IFN一andIL-4inarthriticsynoviumofratsweredeterminedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR).Results:TheexpressionsofTNF-ct,CINCandIFN一inarthriticsynoviumfrompioglitazonetreate

6、dratsweresignificandylowerthanthosefromcontrolgroup,withreducedratesof81.7%,90.9%and65.3%,respectively.TheexpressionofIL一4wasmuchhigherinsynoviumfromtreatedratsthanthatfromcontrolgroup.withaugmentedrateof340.0%.TheratioofIFNT/IL-4Wassuppressedtoanarithmeticrateof92.6%.whilenodifferenceswerefoundinex

7、pressionofIL一18andIL-1Ra.Conclusions:Pioglitazone,aPPARTagonist,mightexertantiinflammatoryeffectsthroughrepressingtheexpressionsofTNFdandCINC,andthroughshiftingtheThlfrh2balancetoaTh2cytokineresponse.whichtendstocontrolarthritis.Keywordsperoxisomeproliferator-activatedreceptorsthiazolidinedionesgout

8、cytokinesrats痛风是由于尿酸钠(monosodiumurate.MSU)晶体在体内析出引发的急慢性炎症反应.急性痛风性关节炎是痛风典型表现形式【".过氧化物酶体增殖物活化型受体y(peroxisomeproliferatoractivatedreceptor,/,PPAR)是一类配体依赖的核受体.PPAR激动剂吡格列酮以改善胰岛素抵抗而广泛应用于2型糖尿病的治疗.研究表明,PPAR活化可产生较强的抗炎作用21.胰岛素抵抗是包括痛风在内的代谢综合征发生的中心环节翻.本研究小组证实吡格列酮可减轻动物急性痛风性炎症,但对其抗炎机制目前缺乏研究.为此,本文研究吡格列酮对滑膜表达多

9、种细胞因子的影响.探讨吡格列酮对痛风性关节炎作用的可能机制.1材料与方法1.1实验动物二级Wistar雄性大鼠(2504-20)g.由军事医学科学院实验动物中心提供并饲养.1.2主要试剂吡格列酮由江苏恒瑞医药股份有限公司惠赠.尿酸钠由TheBritishDrugHousesLTD生产.基质显色鲎试剂购自上海医学化验所.总RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen.RT-PCR试剂盒和DL2000DNAMarker为TaKaRa产品.引物由北京赛百胜生物有限公司合成并纯化.1.3急性痛风性关节炎模型的建立根据笔者研究方法旧制备MSU晶体并建立大鼠急性痛风性关节炎模型.作者单位:10003

10、7北京,海军总医院内分泌风湿科(黄火高,张彦彬,施海燕);心内科(王兆君);军事医学科学院放射医学研究所药理毒理研究室(韩春光,刘永学)通讯作者E-mail:liuyxnic.bmi.ac.Clrl天津医药2007年2月第35卷第2期1.4动物分组和用药方法8只大鼠随机分为模型对照组,吡格列酮用药组.每组大鼠各4只.另取未经任何处理的4只正常大鼠用于检测相关细胞因子的固有表达.将吡格列酮均匀混悬于1%羧甲基纤维素钠悬液中.吡格列酮用药组大鼠于诱发模型前3d按2Omg/(kg?d)剂量开始灌胃给药,1次,d,连续5d.模型对照组大鼠以同样方式给予等体积的1%羧甲基纤维素钠悬液.1.5RT-PCR

11、检测滑膜细胞因子的表达大鼠注射MSU48h后,打开胫跗关节,沿骨骼周边以眼科剪和手术刀片剪切滑膜及其周围组织,于PBS中快速洗涤一遍后立即转入组织匀浆器研磨中以1mLTRIzol抽提总RNA.检测获得的RNA量和纯度后以2O体系将3的RNA逆转录成cDNA模板20,用于PCR检测.所用引物序列和PCR条件.见表1.除了退火温度和循环数.反应程式其他部分均相同:94预变性2min进入循环,94变性45s,不同温度下退火30S,72延伸1min.循环结束后72再延伸5min.降至4.PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳并成像分析,以ImageJ软件(NIH)对产物条带光密度值进行计算.结果以"

12、目的基因/GAPDH"比值表示.表1所用引物序列资料及PCR条件基酩称.:篙nIF吨X66539S5'-GTCGTAGCAAACCACCAAC,-3283-496214bp52/30AS5I-GGrATG从GTGcC¨1G一3广1BM98820S5'-TCTGTGACTCGTGGGATC,-3384-701318bp52AS5_TI11GGcTH研TrcC一3E-libM63101S5'-3W.ATCGTI'-347060414bp52C/35CD87927S5'-CL3W,AGGGACI'GTIF,TGG一378-21113

13、4bp52/32AS5-C,CTAAc1TG.ITCG1B一3巧NM一138880S5-c1-rG"GcCTGAGT-387-397311bp52/35AS5'-TGTGCrC,GATCTGTGGGT一3叫X16058S5'-TGCTGTCACCCIV,13L'W,一351-451柏1bp52/35AS5I-Gc从GT1CCrcGTG一3GAPDHXM_2145375'-CCATC,GAGAA3344-538195bp52/305一C从AG11mTGGA1BACc_3TNF-t(Tumornecrosisfactoralpha,肿瘤坏死因子),ILl(

14、Inter-leukin一1beta,白介素1B),IL一1Ra(Interleukin一1receptorantagonist,白介素1受体拮抗剂),CINC(cytokineinducedneutrophilchemoat.tractant,细胞因子诱导中性粒细胞化学趋化因子),IFNy(Interferongamma,干扰素),IL(Interleukin-4,白介素4),GAPDH(Glycer-aldehyde-3一phosphateDehydrogenase,甘油醛一3壤酸脱氢酶)1.6统计学方法结果以-1-s表示.2组间均数比较方差齐性时以Student-t检验,方差不齐时以近似

15、t检验.统计学软件采用SPSS11.5.2结果2.1大鼠急性痛风性关节炎模型本实验以MSU125诱导的关节炎发生率为100%,表现为急剧发生的关节炎,关节红肿和功能障碍,2h即出现,4h表现明显.812h达高峰,4872h后明显好转,5-6d后自发缓解.2.2正常滑膜细胞因子的固有表达正常滑膜仅微量表达TNFOt(0.0090.010),CINC(0.0064-0.004),IFN一(0.0094-0.003)和IL一4(0.0064-0.oo4),未见IL一1B和IL一1Ra表达.2.3关节炎滑膜细胞因子的表达及吡格列酮的影响关节腔内注射MSU晶体诱导关节炎48h后.滑膜表达各种细胞因子均不

16、同程度增高,以TNF吨,CINC,IL一1B和IL一1Ra增加尤为明显.吡格列酮用药组滑膜表达TNFOt,CINC和IFN一显着低于对照组,抑制率分别为81.7%,90.9%,65.3%;IL一4表达高于对照组,增加率为340.0%;IFN一L一4比值低于对照组,抑制率为92.6%,见表02组IL_1B和IL一1Ra的表达差异无统计学意义,但IL一1B和IL一1Ra表达量存在显着相关性r=0.965,P<0.O1).表22组大鼠滑膜细胞因子表达的结果(n=±s)组另IFN一IL-4IFN一/II,4P<0.05."P<0.013讨论

17、急性痛风性关节炎的根本病因是高尿酸血症及其导致的关节局部MSU晶体的析出.MSU晶体导致大量炎性细胞浸润,促使关节出现剧烈疼痛,红肿和功能障碍.关节炎单次发作的病程包含早期急剧进展,高峰期和自发缓解三个时相【".本实验以MSU诱导的关节炎发生率为100%.表现为急剧发生的关节炎,12h内达高峰,5-6d可自发缓解.结果表明,该动物模型较充分地模拟了人类急性痛风性关节炎的发病过程.研究发现单核因子TNFOt,IL一1B和IL一1Ra,趋化因子IL一8(大鼠中为CINC)和淋巴因子IFN一均不同程度地参与了痛风的病理过程【71.本研究发现正常关节滑膜仅微量表达这些细胞因子.而MSU诱导关

18、节炎48h后这些细胞因子的表达出现不同126程度的增高,尤其以TNFOt,CINC,IL一113和IL一1Ra增加明显,结果与文献报道一致.PPARy主要表达于脂肪组织,也表达于单核/巨噬细胞,淋巴细胞,成纤维细胞和软骨细胞等21.作为核受体超家族成员,PPARy的主要功能是在mRNA水平调控基因的表达.文献报道,激活PPARy可减轻实验性类风湿关节炎81,骨性关节炎91和人的银屑病关节炎【l01.PPARy激动剂的抗炎作用可能通过竞争性结合共激活因子而抑制NFKB和AP一1等转录因子的活性实现21.本研究小组曾证实PPARy激动剂吡格列酮在大鼠痛风性关节炎中有明确的抗炎作用,但需较大的剂量,

19、其机制可能涉及促使巨噬细胞成熟和功能转变.本实验结果表明,吡格列酮可显着抑制大鼠痛风性关节炎滑膜TNFOt和CINC的表达,抑制IFN一y并增加IL一4的表达,显着降低IFN一",filL一4比值,但对IL一1B和IL一1Ra的作用不明显.IFN一y和IL-4分别是Thl/Th2细胞因子的代表,Thl为优势的细胞因子可加重关节炎,相反,Th2为优势的细胞因子则可减轻关节炎1l1.结果提示,抑制TNFOt和CINC的表达及促使Thl/Th2平衡向Th2为优势转化是吡格列酮抗炎作用的重要机制之一参考文献1】PascualE,PedrazT.GoutJJ.CurtOpinRheumatol

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