蛋白质含量的测定

1、食品中蛋白质含量的测定-凯氏定氮法（GB5009.5-2010）原理：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。氨基酸HClN适用范围：适用于各种食品中蛋白质的测定，不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品测定。【实践操作】任务一：仪器设备和试剂的准备1、仪器（1）天平：感量为 1mg； （2）定氮蒸馏装置：如图 1所示； （3）自动凯氏定氮仪：如图2所示；图1定氮蒸馏装置1电炉；2水蒸气发生器（2L烧瓶）；3螺旋夹； 4小玻杯及棒状玻塞； 5反应室；

2、 6反应室外层；7橡皮管及螺旋夹； 8冷凝管； 9蒸馏液接收瓶。 图2自动凯氏定氮仪2、试剂除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的三级水。 （1）硫酸铜（CuSO4·5H2O）；硫酸钾（K2SO4）；硫酸（H2SO4密度为 1.84g/L）；95%乙醇（C2H5OH）； （2）硼酸溶液（20g/L）：称取20g硼酸，加水溶解后并稀释至1000mL；（3）氢氧化钠溶液（400g/L）：称取40g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL； （5）甲基红乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL； （6）亚甲基

3、蓝乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g亚甲基蓝，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至 100 mL；（7）溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL； （8）混合指示液：2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合，也可用1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。任务二：样品预处理样品混匀准确称取液体试样10g25g（约相当于 30mg40mg氮）精确至0.001 g500mL定氮瓶（固体试样 0.2g2g、半固体试样 2g5g）任务三：成分分析食品中蛋白质测定的操作流程如下：搭建装置：水蒸气发生器内装水至2/3处加数粒玻璃珠

4、加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性为红色按图4-6-1搭好装置加热煮沸碱法蒸馏、硼酸吸收：10.0mL硼酸溶液100mL三角瓶加12d混合指示剂冷凝管下端插入三角瓶液面下准确吸取10mL试样由小玻杯流入反应室少量水洗涤小漏斗盖紧玻璃塞量筒10.0mL 40%NaOH溶液倒入小玻杯提起玻塞使其缓慢流入反应室立即塞紧玻璃塞加水于小玻杯防漏气通蒸汽蒸馏计时10min移动接收瓶使液面离开冷凝管下端蒸馏1min用少量水冲洗冷凝管下端外部取下接收瓶盐酸滴定：用盐酸标准溶液直接滴定吸收液颜色变为微红色为终点记录消耗体积湿法消化：定氮瓶中加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾、20mL硫酸、玻璃珠轻摇瓶

5、口放小漏斗45°小心加热至泡沫完全停止大火加热，保持瓶中液体微沸至液体变蓝绿色透明继续微沸30min冷却加20mL水放冷移入100 mL容量瓶定容（同时做空白试验）任务四：结果记录并分析处理食品中蛋白质检测原始记录表（凯氏定氮法）项目名称样品名称接样日期设备检验日期检验依据GB5009.5-2010（第一法）样品质量m（g）盐酸浓度c（mol/L）吸取消化液的体积V3（mL）滴定初读数V初（mL）滴定终读数V终（mL）消耗盐酸的体积V1（mL）吸取空白消化液的体积（mL）1010滴定初读数V初（mL）滴定终读数V终（mL）消耗盐酸的体积V2（mL）计算公式蛋白质（g/100g）平均（

6、g/100g）标准规定分析结果的精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 %。本次实验分析结果的精密度注： 0.01401.0mL 硫酸c (1/2H2SO4)1.000 mol/L或盐酸c (HCl)1.000 mol/L标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为克（g）； F氮换算为蛋白质的系数。一般食物为 6.25；纯乳与纯乳制品为 6.38；面粉为 5.70；玉米、高粱为 6.24；花生为 5.46；大米为 5.95；大豆及其粗加工制品为 5.71；大豆蛋白制品为 6.25；肉与肉制品为 6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为 5.83；芝麻、向日葵为 5.3

7、0；复合配方食品为 6.25。 蛋白质含量1g/100g时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量1g/100g时，结果保留两位有效数字。注意事项：（1）一般消化至呈透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以氨化的含氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。（2）装置搭建好了之后要先进行检漏，利用虹吸原理。（3）在蒸汽发生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性，以防氨蒸出。（4）加入NaOH一定要过量，判断NaOH是否过量的方法，看反应室内液体颜色，呈深蓝色或灰色沉淀。蒸馏前若加碱量不足，消化

8、液不生成Cu(OH)2沉淀，要增加碱用量。 图3碱法蒸馏时反应室内颜色的变化（5）加热蒸馏出来的氨可以用硼酸进行吸收，因为硼酸只呈微弱酸性，不影响指示剂的变色反应，但是具有吸收氨的作用，与氨形成强碱弱酸盐。（6）冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏，吸收液温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱，造成检测结果偏低，可把接收瓶置于冷水浴中。（7）检验蒸馏是否完成的方法：奈氏试纸法。原理：NH4+或NH3遇奈氏试剂会反应生成综红色的碘化汞铵化合物，如NH4+或NH3含量较少，试纸呈黄色，若含量过多，呈棕黄色或棕红色的沉淀反应。（8）在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽，否则会发生倒吸。（9）蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端