丙戊酸钠诱导骨髓增生异常综合征细胞株 MUTZ1凋亡的实验研究

1、丙戊酸钠诱导骨髓增生异常综合征细胞株 MUTZ1凋亡的实验研究         08-03-03 15:22:00     编辑：studa20     作者：赵慧慧，陈宝安, 高冲，邵泽叶，夏国华，丁家华，孙耘玉，【摘要】  为了探讨丙戊酸钠( sodium valproate， VPA)对骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ1的生长抑制及诱导凋亡作用，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测VPA对细胞生长的抑制作用；采用光学显

2、微镜和电子显微镜观察VPA作用后细胞形态的变化；应用流式细胞术(FCM)检测不同浓度VPA作用后细胞凋亡的比例和细胞周期分布的变化。结果显示： VPA对MUTZ1细胞的生长抑制作用呈现时间和剂量依赖性；经4 mmol/L VPA处理MUTZ1细胞72小时后,细胞呈现典型的凋亡形态特征，光学显微镜下可见凋亡细胞胞体固缩、核固缩、核碎裂及凋亡小体；透射电子显微镜下可见凋亡细胞核染色质边集、胞浆浓缩、密度增加，胞浆内大小不规则的染色质团块；流式细胞术结果表明，细胞凋亡率随着VPA浓度的增加而逐步增高，G0/G1期细胞比例随着VPA浓度的增加而逐渐增多，S期细胞比例逐渐减低,细胞被阻滞在G0/G1期。

3、结论： VPA通过G0/G1期阻滞诱导MUTZ1细胞凋亡，从而抑制MUTZ1细胞增殖。 【关键词】  骨髓增生异常综合征      Apoptosis of Human Myelodysplastic Syndrome Cell Line MUTZ1 Induced by Sodium Valproate       Abstract    To study the effects of sodium valproate (VPA) on hum

4、an myelodysplastic syndrome cell line MUTZ1. The  cell proliferation was determined by  MTT assay, apoptotic morphological features were observed by light microscopy and transmission electronmicroscopy, cell apoptosis and cell cycle shift were analyzed by flow cytometry (FCM). The results

5、showed that VPA could inhibit the growth of MUTZ1 cells in doseand timedependent manners. The typical apoptotic morphological features appeared in MUTZ1 cells treated with 4 mmol/L VPA for 72 hours. Pyknosis of cells and nuclei, disintegration of nuclear chromatin and apoptotic body could be observe

6、d by light microscopy. Aggregation and margination of  nuclear chromatin,     concentration of plasm, increment of density and chromatin mass of irregular size could be observed by  transmission electronmicroscope. The flow cytometric analysis indicated that the VPA cou

7、ld induce cell apoptosis, apoptosis rate increased in dosedependent manner, ratio of cells at G0/G1 phase increased and ratio of cells at S phase decreased  in dosedependent manner, the cells were arrested at G0/G1 phase. It is concluded that the VPA can induce apotosis and inhibite proliferati

8、on of MUTZ1 cells via arresting cells at G0/G1 phase.    Key words    sodium valproate； MDS； MUTZ1 cell line； apoptosis    J Exp Hematol 2007; 15(4):743-747    骨髓增生异常综合征(MDS)是一组以血细胞质、量异常和高风险发展为急性白血病为特征的恶性克隆性造血干细胞疾病。由于本病具有高度的异质性,目前临床尚无明确有效的治

9、疗方法。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACI）可通过诱导细胞周期停滞、细胞凋亡抑制多种肿瘤细胞的生长增殖1-3，它的应用标志着一种全新的肿瘤治疗途径。丙戊酸钠(sodium valproate, VPA)是一种传统的抗癫痫病药物，毒副作用轻微，长期使用耐受性好，其在抗癫痫病有效治疗浓度时表现出很强的HDACI活性4。    本实验研究了VPA抑制MDS细胞株MUTZ1生长增殖以及诱导其凋亡的作用。     制剂和试剂    VPA由连云港恒瑞制药厂惠赠,纯度为99.2% ,分子式为C8H15NaO

10、2,以PBS配制成0.5 mol/L浓度,过滤分装,贮存于-20,实验证明所用药物浓度的PBS含量对细胞生长无影响。RPMI 1640培养液为Gibco公司产品，小牛血清购自杭州四季清有限公司，四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲亚砜（DMSO）为Sigma公司产品，Annexin VFITC凋亡和细胞周期分析试剂盒为Becton Dickinson公司产品。    细胞和细胞培养    人MDS细胞株MUTZ1来源自德国Brauschweig细胞中心5。MUTZ1是MDSRAEB细胞系,免疫表型显示前B细胞的表面标记(CD10+,CD19

11、+,cyIgM+),染色体核型表现为高频率的染色单体断裂及交换、5号染色体长臂的丢失6。细胞在5% CO2, 37条件下,用含10%小牛血清,青霉素(100 U/ml),链霉素(100 g/ml)的RPMI 1640培养液培养传代。实验所用细胞均处于对数生长期，台盼蓝拒染法表明细胞活力95%。    MTT比色试验    取对数生长期细胞，洗涤，重悬于含10%小牛血清RPMI 1640培养液中，调整细胞终浓度为1×105/ml，接种于96孔板,加入不同浓度的VPA,每孔总体积为200 l,另设空白孔和对照孔，每个浓度设5个复

12、孔,分别于加药后0、1、2、3和4天进行检测,于每次检测前4小时每孔加入MTT溶液(5 mg/ml) 20 l; 37，5% CO2条件下继续孵育4小时,然后终止培养，离心、弃上清,每孔加入150 l  DMSO,摇床混匀充分溶解结晶物；在全自动酶标仪波长540 nm处测定吸光度A值。试验重复3次,取平均值。    光学显微镜下细胞形态学观察    4 mmol/L VPA处理MUTZ1细胞72小时后收集细胞悬液,离心 ,涂片,常规WrightGiemsa染色,观察细胞形态。    透射电子显微

13、镜下细胞形态学观察    4 mmol/L VPA处理MUTZ1细胞72小时后收集细胞悬液,离心后快速固定于2.5%的冷戊二醛液中，2小时后，1%锇酸再固定1小时，丙酮梯度脱水，Epon812树脂包埋，半薄切片定位，70 nm超薄切片，醋酸铀柠檬酸铅双重电子染色，在JEM1200透射电子显微镜下观察。    细胞凋亡和细胞周期的流式细胞术检测    分别收集0、1、2和4 mmol/L VPA处理72小时的细胞, 4用PBS洗涤2次,1×AnnexinV缓冲液悬浮细胞,调整细胞浓度为1×

14、;106/ml,取100 l悬液,加入AnnexinVFITC 5 l， PI  10 l，避光孵育15分钟,每管加入300 l的1×AnnexinV缓冲液,FCM检测凋亡细胞阳性率。AnnexinV()PI()为活细胞, AnnexinV()PI(+)为机械损伤细胞， AnnexinV(+)PI()为早期凋亡细胞, AnnexinV (+)PI(+)为晚期凋亡细胞，实验中以AnnexinV（+）作为凋亡细胞。    分别收集0、1、2和4 mmol/L VPA处理72小时的细胞(约2×106个),用PBS洗涤2次,用70%的冷乙醇于

15、4下固定24小时以上,离心并重悬于1 ml PBS,加1 ml  PC缓冲液,置室温20分钟,离心去上清,加100 g/ml RNase 50 l,再加入50 g/ml PI  500 l ,4 室温避光30分钟，FCM分析细胞周期。    统计分析    应用SPSS 11.5统计软件进行统计,应用t检验分析实验组和对照组之间的差异,以p0.05为差异具有显著意义。    结    果    VPA对MUTZ1细胞生长的抑制作用    0.5 mmol/L  VPA作用于MUTZ1细胞后对细胞的生长增殖无明显影响（p0.05），而较高浓度（1-6 mmol/L）的VPA可明显抑制细胞的