p185抗体可致小鼠流产的研究

1、    p185抗体可致小鼠流产的研究        【摘要】目的通过体内实验进一步验证p185蛋白的免疫原性，旨在研究该蛋白作为肿瘤疫苗的可能性。方法用Sephadex G200层析柱分离的p185蛋白组分与佐剂混合免疫BALB/c小鼠，经ELISA验证血清中出现p185抗体后与健康的同品系雄性鼠交配，以阴栓形成提示交配成功，观察雌鼠产仔率，子宫形态及免疫病理。结果免疫鼠产仔率明显低于仅用佐剂免疫的对照组(P0.05)，子宫内发现胚胎坏死，病检显示子宫组织有弥散性中性粒细胞

2、浸润和局灶性坏死，并有免疫复合物沉积，提示p185免疫能诱导小鼠流产。结论这一实验结果从体内进一步证实p185的免疫原性。为该蛋白作为肿瘤疫苗提供实验资料，同时该模型可用于对胚胎性肿瘤抗原的免疫原性研究。【主题词】p185蛋白流产肿瘤胚胎抗原抗原，肿瘤 Study on miscarriage of mice immunized with p185Li Xiaohua*,Qon Huilian,Mery L Disis,et al. * Department of Immunology,Shanghai Medical University,Shanghai 200032【Abstract】O

3、bjectiveTo identify the immunogenicity of p185 onco-protein in vivo and to study its possibility as a tumor vaccine. Methodsp185 HER2/neu onco-protein crude products,derived from 3T3-neu transfected cell lysates by Sephadex G200 chromatography column,were used with adjuvant to ip immunize female BAL

4、B/c mice.When 185 antibody positive the mice were mated with males.Successful mating was evidenced by the presence of vaginal embolus. ResultsThe average of the offspring per delivery from immunized mice was significantly lower than that from the control mice immunized with adjuvant alone.The pathol

5、ogical findings revealed that there were diffused infiltration of neu-trophiles,focal necroses as well as immunocomplex deposits on the wall of uterus resulting in necrotic fetuses.These indicated that the pregnant mice which had been immunized with p185. ConclusionsAbove results suggest the p185 on

6、co-protein are the tumor antigen and can induce the immune response in BALB/c mice.This model may be useful for studying the immunogenicity of the fetal tumor antigen.【Subject words】p185 onco-proteinAbortionFetal tumor antigenAntigen,neoplasm原癌基因HER2/neu编码的分子量为185000跨膜糖蛋白，属于生长因子类受体家族，它具有PTK激酶活性1。该蛋白

7、在哺乳类的胎盘及胚胎器官组织表达较高2，3，且在不同种属间有较高的同源性4。人类肿瘤细胞p185产物表达量的升高与肿瘤的发展及不良预后密切相关5，6。已有实验资料提示，p185在恶性肿瘤细胞上的高表达使它有可能作为肿瘤免疫治疗的靶抗原。我们曾报道，用表达p185的3T3-neu转基因细胞的膜裂解物可诱导BALB/c鼠产生较强的免疫应答反应，说明p185具有免疫原性7，8。由于无乳腺癌的小鼠动物模型，无法在体内研究p185的免疫原性，因此我们利用该抗原在胚胎组织中高表达，设计通过免疫雌性鼠诱导其流产，从而验证p185的免疫原性。材料与方法1.细胞株：3T3-neu 细胞为转染人HER2/neu全

8、长cDNA的小鼠纤维母细胞，经ELISA检测高表达p185蛋白。2.试剂：Sephadex G200 为Pharmacia产品，粒度40120m.制备型层析柱25×95cm,Tris-HCl(pH7.0)缓冲液为样品洗脱液。抗p185胞外区单抗(c-neu,Oncogen science Inc产品)。3.动物：雌性/雄性BALB/c鼠，1618g体重，购自上海生物制品研究所。4.p185蛋白的粗制品：3T3-neu细胞108，加裂解液10ml(1mmol/L PMSF,1mmol/L Benzamidine,1g/ml Aprotinin),4作用60分钟，10000r/min低温

9、离心去沉淀，上清过Sephadex G200层析柱，用蛋白检测仪和ELISA检测p185洗脱峰，混合各阳性管为p185粗提物，用p185单抗免疫沉淀后作Western blot分析，经PBS透析后测蛋白浓度，分装保存于-20。5.动物免疫：用上述p185粗制品100g/ml辅以福氏佐剂按常规皮下免疫BALB/c雌性鼠，经3次免疫后1012天从眼眶静脉取血，用我室的SKBR3-细胞ELISA法9验证p185抗体产生。用单独福氏佐剂免疫为对照组。6.动物交配及流产的研究：将经p185粗制品免疫并证实产生抗体的雌性鼠与雄性鼠按31比例同笼饲养，通过观察雌性鼠阴栓的形成确证其交配成功，通过计算各组每只

10、鼠的平均产仔数及各阶段解剖小鼠子宫观察流产情况，用福尔马林即刻固定子宫组织并做病理检查。7.HE染色及免疫荧光染色：均按常规方法进行。荧光染色法检测免疫复合物简述如下：切片按常规脱蜡，经PBS充分洗涤以去除可能存在的非特异性IgG粘附，用蒸馏水漂洗脱盐，加FITC-抗鼠IgG复合物(第二军医大学免疫学教研室曹雪涛教授提供)，37反应30分钟后用PBS冲洗，荧光显微镜观察。结果1.3T3-neu 细胞裂解上清经Sephadex G200层析后P185蛋白的收集：取10ml的3T3-neu细胞裂解上清作为Sephadex G200层析柱分离，经Tris-HCl缓冲液洗脱，A280监测蛋白洗脱峰，样

11、品经ELISA检测证实p185存在于第一个蛋白峰中。混合各阳性管作为p185蛋白粗提物，进一步与c-neu5单抗反应作Western blot分析，证实p185蛋白存在(1)。1Sephadex G200分离p185蛋白的Western blot鉴定Fig1. Western blot of p185 onco-protein crude products derived from 3T3-neu transfected cell lysates by Sephadex G200 chromatography colum.A.Marker; B.The pellets of cell lysi

12、s; C.The supernatant of cell lysis; D.The Immunoprecipitate p185 protein in crude products with c-neu 5 anti-p185 McAb2.免疫BALB/c鼠血清中p185抗体水平检测：免疫鼠血清经人的乳腺癌细胞株MCF-7(p185蛋白低表达)预吸收后用另一高表达p185蛋白的SKBR-3人乳腺癌细胞株作为抗原检测交配前后血清中的抗体水平，结果(表1)显示免疫组鼠产生p185抗体阳性，且在交配后23天血清中仍有较高水平抗体。 表1免疫鼠p185抗体水平Table1. p185 antibody

13、 from immunized BALB/c mice by ELISAGroupnAB (A value±s)Before matingAfter pregnancyImmunized70.60±0.090.51±0.02Control60.18±0.010.16±0.033.免疫鼠产仔数：免疫雌性鼠与雄性鼠交配后平均21天即产仔，各组每鼠平均产仔数(见表2)显示，用p185免疫的雌性鼠平均产仔数明显低于用单独佐剂免疫的对照组，统计学处理差异显著(P0.05)。 表2免疫鼠产仔数Table2.The number of offspring p

14、er delivery of immunized BALB/c miceGroupnOffspring per deliveryImmunized75.3±3.3Control610.5±2.54.免疫鼠子宫解剖结果：小鼠交配后各时期解剖小鼠子宫，5号免疫鼠在交配15天后腹部较小，显示胎盘节结形成，但未见正常成熟胎盘形成，表现出胎盘吸收迹象。6号免疫鼠产下3只仔鼠后立即解剖子宫，发现内有坏死胎盘。对照组小鼠均未发现上述现象。5.子宫病理检测结果：流产鼠子宫组织切片HE染色(见2，3)，大部分流产鼠子宫组织的腺体表皮下间质中有中性粒细胞浸润，呈弥散性广泛分布。免疫荧光染色显示

15、子宫内膜有免疫复合物沉积。部分组织的腺体上皮中也发现有中性粒细胞，有局灶性坏死。2免疫小鼠子宫组织切片，HE染色显示上皮组织中有大量中性粒细胞浸润Fig2. The HE-stained section of uterus showing inflammation granulocyte in glandular epithelium tissues3免疫小鼠子宫组织切片，HE染色显示上皮组织中有局灶性坏死Fig3. The HE-stained section of uterus showing inflammation granulocyte and focal necrosis in g

16、landular epithelium tissues讨论p185蛋白由原癌基因编码，在哺乳动物正常组织中几乎不表达，而在胚胎中的皮肤、生殖系统(输卵管、子宫内膜、子宫颈)，消化系统的大部分组织以及泌尿系统的肾脏、输尿管和膀胱组织细胞表面高表达2，3，故有学者将之归为胚胎抗原。1995年Venanzi等10报道用转染HER2/neu cDNA的表达质粒免疫雌性Swiss鼠，发现被免疫的鼠出现流产迹象，他在排除了因免疫可能引起的人为组织损伤或诱生循环DNA抗体导致流产的可能性，认为免疫鼠流产的原因有可能是一种免疫应答。为此，我们利用动物流产模型研究癌胚胎抗原的免疫原性。如果母体产生针对p185的

17、抗体为IgG，可能通过胎盘与表达在胚胎细胞表面的P185蛋白结合，激活补体攻击胚胎细胞，趋化炎症细胞导致组织坏死等直接影响胚胎的形成或发育最终引起流产。基于上述设想，p185蛋白免疫雌性小鼠，当抗体产生时与健康雄性鼠交配，观察是否发生流产现象。结果免疫组与佐剂对照组的产仔数有显著差异(P0.05),前者产仔数明显减少，病检显示免疫鼠子宫组织中有炎症中性粒细胞浸润，有坏死灶形成，提示p185抗体有可能从母体进入胚胎与表达于胚胎细胞表面的p185反应诱导流产这一事件，据此再次验证p185肿瘤抗原的免疫原性。利用动物流产的模型研究胚胎蛋白的免疫原性，具有一定的实用性和普遍意义，可为癌胚抗原作为免疫原

18、的研究提供新思路。 本课题受国家自然科学基金资助(39640009)作者单位：200032 上海医科大学免疫学教研室(李晓华，秦慧莲，何球藻)；Division of oncology,University of Washington Medical Center(Mery L.Disis)参考文献1Coussens L,Yang-Feng TL,Chen YLE,et al.Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogen.

19、Science,1985,2301132-1138.2Press MF,Cordon-cardo C and Slamon DJ.Expression of the HER-2/neu proto-oncogene in normal human adult and fetal tissues.Oncogene,1990,5953-962.3Gullick WJ,Berger MS,Bennett P L P,et al.Expression of the c-erbB-2 protein in normal and transformed cells.Int J Cancer,1987,40246-254.4Bargmann C,Hung M,and Weinberg R.The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein.Nature,1986,319226-230.5Lenmoine N,Staddon S,Dickson C,et al.Absence of activating tran