先天性肾上腺皮质增生症患者21-羟化酶基因启动子区域突变的初步研究

1、    先天性肾上腺皮质增生症患者21-羟化酶基因 启动子区域突变的初步研究        【摘要】目的研究先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia, CAH)患者21-羟化酶基因启动子区域的突变。方法用PCR、SSCP、内切酶酶谱分析及测序分析方法对12例CAH患者的21-羟化酶基因启动子区域进行研究。结果12例患者中有6例出现异常SSCP条带，其中1例在CK-2(-101)结合区域内的Kpn 内切酶识别位点及其-201

2、处的Taq 内切酶识别位点存在突变，并经测序证实。结论在CAH患者-21羟化酶基因启动子区域存在突变，可能为CAH发病机理之一。【关键词】先天性肾上腺皮质增生症21-羟化酶基因突变Mutations in the promoter region of 21-hydroxylase gene of patients with congenital adrenal hyperplasiaZHAO Yi*, YE Jun, YANG Xinwen, GU Xuefan.*Laboratory of Molecular Medicine, Xin Hua Hospital, Shanghai Seco

3、nd Medical University,Shanghai, 200092 P.R. China.E-mail:xhkjpublic. . cn【Abstract】ObjectiveTo investigate the mutations in the 21-hydroxylase gene promoter region of patients with congenital adrenal hyperplasia (CAH).MethodsThe authors amplified a 1.6kb fragment of the CYP21 gene which was confirme

4、d by endonuclease digestion. The PCR product was re-amplified with promoter-region-specific primers. The amplified fragments were analyzed using SSCP and endonuclease digestion methods.ResultsAmong 12 patients, 6 patients presented an abnormal band on SSCP analysis. By endonuclease digestion test, t

5、he authors found a patient who presented one mutation in Kpn recognition site located in the CK-2(-101) binding region and one in Taq recognition site located-201. These mutations were confirmed by sequencing. ConclusionNovel mutations were found in the promoter of 21-hydroxylase gene in CAH patient

6、s and the findings spurred on further expression studies.【Key words】Congenital adrenal hyperplasia21-hydroxylaseGene mutation先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia, CAH)是一类常染色体隐性遗传性疾病，因肾上腺皮质激素代谢途径中一些酶缺陷引起代谢异常，其中21-羟化酶(21-hydroxylase,CYP21)缺乏占95%左右。大多数研究表明，21-羟化酶的缺陷是由于功能基因缺陷所致，已确认的功能基因缺陷包括：基因大片段缺

7、失、基因转化和点突变1，2。为评价基因调控区域和临床疾病的关系，我们对CAH患者CYP21基因启动子区域进行了突变检测。1材料和方法1.1研究对象12例CAH患者均经我院儿科确诊为21-羟化酶缺陷，诊断标准为：女性出现男性化症状和体征，男性伴性早熟，尿24小时17-酮类固醇升高，部分患者测定了血17-羟孕酮，均显著增高。在12例患者中，3例为失盐型，9例为单纯型。取患者和父母静脉血，按常规方法抽提DNA3。1.2引物参照文献4合成，引物序列为：正向引物P1：5-AGAAAGCTGACTCTGGATGCAGGA-3(-271)，反向引物P2：5-TGCATCTCCACGATGTG-AT-3(+1

8、396)；P3：5-AGCTTCCACCAGTTCC-ACA-3(+72)(上海生物工程公司合成)。Taq DNA聚合酶购自Promega公司，32P-dATP购自Amershan公司。1.3PCR扩增按常规方法，在PE2400型扩增仪上进行。反应体积为25l，含10×反应缓冲液2.5l、1.5mmol/L MgCl2、200mol/L dNTP、7.5pmol引物和Taq DNA聚合酶1U。PCR产物经20倍稀释后，取2l做模板，在95预变性5分钟后，进入循环。扩增CYP21基因序列时(首次扩增引物为P1和P2，模板DNA约50ng)循环条件为：9440秒，6440秒，721分30

9、秒；巢式扩增CYP21基因启动子区域时(引物为P1和P3)循环条件为：9440秒，6840秒，7240秒；最后72延伸7分钟。每次扩增均为25个周期。1.4CYP21基因序列特异扩增片段的鉴定首次PCR扩增产物经电泳证实为1663bp的单一条带后，取PCR产物5l，在EcoR限制性内切酶作用下，37消化过夜，再经8%聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺为391)电泳观察结果5。1.5CYP21基因启动子区域的SSCP分析将巢式PCR反应体积减半，掺入32P-dATP0.05l进行扩增，然后取PCR产物1l，加入2l上样液(95%甲酰胺、0.05%溴酚蓝和0.05%二甲苯菁)，经96变性10分钟

10、，立即冰水浴5分钟，在8%聚丙烯酰胺凝胶(391)上电泳。凝胶含10%甘油，胶厚0.4mm，0.5×TBE电泳液，200V电压，4条件下电泳12小时，再经干胶机干燥后，用Kodak-XK1胶片曝光1224小时，洗片观察结果。1.6CYP21基因启动子区域的PCR-RFLP分析取非同位素掺入的巢式PCR产物各5l，分别加入2U的Taq 限制性内切酶和2U的Kpn限制性内切酶消化过夜，再经8%聚丙烯酰胺凝胶(391)电泳观察结果。1.7CYP21基因启动子区域突变的测序分析首次PCR产物经割胶纯化后做模板，以巢式PCR扩增的引物做测序引物，掺入32P-dATP，以Sequenase Ve

11、rsion 2.0 DNA Sequencing Kit (Amersham公司)进行测序。2结果2.1CYP21基因扩增特异性的鉴定分析对21-羟化酶基因序列分析可知，CYP21基因特异的扩增产物经EcoR限制性内切酶作用后，产生1242bp和421bp两个片段，而相应的CYP21P基因PCR扩增产物经此酶作用后，则产生753bp、496bp和416bp 3个片段。我们的扩增产物经EcoR作用后只产生1242bp和421bp两个片段，说明我们的扩增产物是特异的(1)。1CYP21基因扩增特异性分析1：CYP21基因首次PCR扩增产物；2：CYP21基因PCR扩增产物经EcoR限制性内切酶作用

12、后的电泳结果；M：pGEM-3Zf(+)/Hae消化的分子量标准Fig 1Analysis of the specificity of the amplified fragmentfrom the CYP21 geneLanes 1:first amplified fragment from the CYP21 gene; lane 2:the result of digestion of the amplified fragment from the CYP21 gene with endonuclease EcoR ; lane M:pGEM -3Zf(+)/Hae marker2.2CA

13、H患者CYP21基因启动子区域的SSCP分析结果在4电泳条件下，6例患者出现异常位置的电泳条带，它们是泳道3、6、7、10、11和12，其中泳道3、6、11和12的位置相同，而泳道7和10则不同(2)。2CAH患者CYP21基因启动子区域的SSCP分析结果1、2、4、5、8和9：正常；3、6、7、10、11和12：异常Fig 2SSCP analysis of the promoter region of CAH patientsLanes1,2,4,5,8 and 9 are normal patterns; lanes 3,6,7,10,11 and 12 are abnormal pat

14、terns2.3CAH患者CYP21基因启动子区域PCR-RFLP分析结果12例患者CYP21基因启动子区域的PCR扩增产物经Kpn限制性内切酶和Taq限制性内切酶作用后，发现1例单纯型患者(2中泳道10)的1个等位基因在-101位点的Kpn限制性内切酶酶切位点消失，在-201位点产生1个Taq限制性内切酶识别位点，经酶切作用后产生65bp和277bp两个片段，证明在CYP21基因启动子区域有突变产生(3)。3CAH患者CYP21基因启动子区域PCR-RFLP分析结果a：1为CYP21基因启动子区域的PCR扩增产物；2、3和4为CYP21基因启动子区域的PCR扩增产物经Kpn酶切后的电泳结果，

15、其中4显示异常；M：pGEM-3Zf(+)/Hae消化的分子量标准；b：1为未经酶切的PCR产物；2、3和4为PCR扩增产物经Taq 酶切后的电泳结果，其中4有异常；M：pGEM-3Zf(+)/Hae消化的分子量标准Fig 3Analysis of the mutations at the promoter region of the CYP21 gene in CAH patients by PCR-RFLPa: Lane 1 is the amplified fragment from the promoter region of the CYP21 gene; lanes 2,3 and

16、 4 are the results of digested result of the amplified sequence of the promoter region of the CYP21 gene with endonuclease Kpn , among these lanes, lane 4 is the pattern with mutation; Lane M is pGEM-3Zf(+)/Hae marker;b:Lane 1 is the amplified fragment from the promoter region of the CYP21 gene; lan

17、es 2,3 and 4 are the results of digested result of the amplified fragment from the promoter region of the CYP21 gene with endonuclease Taq , among these lanes, lane 4 is the pattern with mutation; lane M is pGEM-3Zf(+)/Hae marker2.4CYP21启动子区域突变的测序结果测序证实了所发现的两种突变的存在，并发现这两种突变位于同一个等位基因上，在同一条等位基因上-210位点

18、产生突变(TC)，出现Taq 限制性内切酶位点(TCGA)；在-110位点产生突变(TC)，Kpn限制性内切酶位点(GGTACC)消失(4)。4CYP21基因启动子区域突变的测序结果a:左为正常-210位点的T，右为突变-210位点的C；b：左为正常-110位点的T，右为突变-110位点的CFig 4Analysis of the mutations at the promoter region of the CYP21 gene by sequencinga:left shows the normal base T(-210),right shows the normal base C(-2

19、10);b:left shows the normal base T(-110),right shows the normal base C(-110)3讨论21-羟化酶基因定位于染色体6p21.3，分为功能性CYP21基因(又称CYP21B)和非功能性CYP21P基因(又称CYP21A或假基因)，两个基因有98%的同源性。二者分别位于编码补体C4的C4A和C4B基因的下游，并与之紧密连锁形成前后重复的C4ACYP21P和C4BCYP21单位1，2。以往的研究结果表明，21-羟化酶的缺陷是由于功能基因缺陷所致，大多数引起疾病的突变都是由于CYP21基因与CYP21P基因的相互作用而产生，导致C

20、YP21基因的缺失或CYP21基因与CYP21P基因间的序列转换，从而影响了功能基因的活性，其转换机制尚不清楚。在CYP21基因的全部突变中，最常见的突变是基因缺失、内含子2剪切突变、Ile173Asn和Val282Leu等突变7-9；另一些突变可能发生在CYP21基因调控区域，从而影响基因转录活性，间接导致21-羟化酶活性改变。有研究发现，CYP21基因的调控序列基因活性比CYP21P高27倍，且真、假基因启动子区域的活性有方向依赖性，在-230区域内存在结合转录因子AGE-IB(Nur-77)的序列，该转录因子可接受ACTH的刺激而增强转录活性，在-117区域有结合转录因子CK-2(-10

21、1)的序列10。如果这些位置发生突变，将导致转录活性下降。我们重点对CYP21基因调控区域进行了突变研究。由于真、假基因之间有很高的同源性，在特异扩增CYP21基因启动子区域时，应避免CYP21P启动子区域的扩增。我们先采用特异性引物扩增了包含CYP21基因启动子区域和编码区域1.6kb序列，并经内切酶消化证实为特异性扩增。又采用巢式PCR扩增CYP21基因启动子区域，然后进行SSCP分析，保证了分析的可靠性。通过SSCP分析，发现有6例患者SSCP条带存在差异，有3种异常模式。通过对真、假基因启动子区域的序列分析，可知正常人群中的CYP21基因启动子区域特异的PCR扩增产物经Kpn 限制性内

22、切酶(作用于-101位置)作用后，可产生164bp和178bp两个片段，而无Taq 限制性内切酶(作用于-201位置)识别位点。如果Kpn 限制性内切酶酶切位点消失，或经Taq 限制性内切酶作用后，产生65bp和277bp两个片段，则说明CYP21基因启动子区域有突变产生。我们采用Taq 限制性内切酶和Kpn 限制性内切酶分别对12例患者的启动子区域特异的PCR扩增产物进行酶切分析，结果发现1例单纯型患者启动子区域有两种基因突变，其中一种发生在CK-2(-101)转录因子结合位置，一种发生在-201处的Taq 内切酶识别位点，这些突变经过测序证实，并显示这两个突变位于同一个等位基因上。根据真、

23、假基因序列分析比较，这两种突变发生的部位均是两基因DNA序列有差异的部位，很可能因启动子区域发生不等位转换而引起。我们的研究结果证实CYP21基因启动子区域存在突变，因此应重视CYP21基因调控区域突变的研究，并进一步研究启动子区域突变的发生频率、功能及其与非调控序列突变的关系。本课题由上海市科学技术发展基金(954119031)资助作者单位：200092上海第二医科大学附属新华医院分子医学实验室(赵毅、杨新文、顾学范)；上海市儿科医学研究所(叶军)参考文献1Miller WL,Levine LS. Molecular and clinical advances in congenital a

24、drenal hyperplasia: report of a new case. Eur J Pediatr, 1990, 149(4)237-240.2Haglund-Stengler B, Martin RE, Gustafsson J, et al. Haplotypes of the steroid 21-hydroxylase gene region encoding mild steroid 21-hydroxylase deficiency. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88(19)8352-8356.3J 萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯.

25、真核基因组DNA的分析和克隆.见：金冬雁，黎孟枫主编.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992.463-468.4Chung BC, Hu MC, Guzov VM, et al. Structure and expression of the CYP21 (P450c21,steroid 21-hydroxylase)gene with respect to its deficiency. Endocr Res, 1995, 21(1-2)343-352.5Migeon CJ, Donohoue PA. Congenital adrenal hyperplasia caused by 21-hydroxylase deficiency. Its molecular basis and its remaining therapeutic