人截短型凋亡诱导因子对HeLa细胞的促凋亡作用(1)

1、    人截短型凋亡诱导因子对HeLa细胞的促凋亡作用(1)    】 目的：观察人截短型凋亡诱导因子(AIF1-400)对HeLa细胞的促凋亡作用. 方法：在AIF1-120基因克隆成功的基础上进一步改造，构建截去AIF基因线粒体定位信号,FAD结合结构域和NADH结合结构域（1-400位氨基酸）编码序列的AIF1-400基因，将其克隆入pcDNA3和pIRES2EGFP真核表达载体，用脂质体法转染HeLa细胞，通过荧光显微镜观察,MTT检测等方法检测该基因在转染细胞中的表达及其对肿瘤细胞的促凋亡活性. 结果：经

2、酶切鉴定与测序证实，带有AIF1-400的真核表达载体构建成功瞬时转染后出现细胞形态变化，随转染时间的延长转染细胞数减少，荧光变弱 经间接免疫荧光检测可观察到截短型AIF蛋白位于细胞质中，部分已位于细胞核内 MTT法检测发现AIF1-400转染后对细胞生长有明显的抑制作用. 结论：AIF1-400仍然具有诱导HeLa细胞凋亡的作用.【关键词】 凋亡诱导因子；HeLa细胞；细胞凋亡0引言凋亡诱导因子（apoptosisinducing factor ，AIF）是1996年发现的一种凋亡诱导蛋白，全长为613个氨基酸（aa），成熟的AIF分子为559个aa，由3部分构成：1个FAD结合结构域（12

3、2262 aa和400477 aa）,1个NADH结合结构域（263399 aa）和1个C末端结构域（478610 aa）. 在细胞中表达后定位于线粒体膜间隙中1. 当凋亡信号刺激时可检测到AIF分子从线粒体释放到细胞质，然后转位到细胞核内，直接介导细胞核发生凋亡2-4. 研究表明AIF介导的细胞凋亡在胚胎形成时期起重作用5. 体外实验证明，显微注射AIF分子能引起分离的细胞核中部分DNA丢失，染色体周边凝集和DNA呈大片段断裂（50 kb）. 这些作用不受广谱caspases抑制剂zVAD. fmk的抑制，也不受Bcl2过量表达的影响1，代表着独立于caspase信号通路之外的另一条凋亡途径

4、5. 在成功构建AIF1-120基因的基础上6，我们对AIF基因的结构7进行了进一步截短并构建AIF1-400基因，旨在研究其对HeLa细胞的促凋亡活性.1材料和方法1.1材料pcDNA3AIF1-120质粒为第四军医大学免疫学教研室构建， E.coli DH5菌种、 人HeLa细胞系为第四军医大学免疫学教研室保存和培养；载体pcDNA3由第四军医大学免疫学教研室保存；载体pIRES2EGFP（ Clontech公司）；Taq DNA聚合酶，DNA限制性核酸内切酶，T4 DNA连接酶（TaKaRa公司）；新生牛血清（杭州四季青生物公司）；RPMI 1640及脂质体LipofectAMINETM

5、2000（ Invitrogen公司）；山羊抗人AIF多克隆抗体（Santa Cruz公司）；FITC标记兔抗山羊二抗（中杉公司）.1.2方法1.2.1引物设计根据AIF的基因序列设计引物为zy1（5TTT GGT ACC GAA TTC CACC ATG GAG CCC AAT GTT GAG TTG GCC3）和zy2（5TTT TCT AGA GTC GAC TCA GTC TTC ATG AAT GTT GAA TAG3）.1.2.2AIF1-400真核表达载体的构建以质粒pcDNA3AIF1-120为模板，用zy1和zy2进行PCR,扩增出AIF基因 400位氨基酸密码子以后的片段.

6、 将该基因片段经EcoR和Xba双酶切后克隆入pcDNA3载体的相应位点， 并转化E.coli DH5菌株， 挑克隆，提取质粒，酶切鉴定，鉴定正确的克隆由北京奥科公司测序，将测序正确的质粒命名为pcDNA3AIF1-400. 同时构建绿色荧光蛋白共表达载体pIRES2EGFPAIF1-400.1.2.3细胞转染于细胞转染前24 h，用胰酶消化生长至对数期的HeLa细胞，于放置玻片的24孔板中培养，待细胞达80%汇合率时进行转染. 细胞爬片先用无血清RPMI 1640洗2次，加0.5 mL无血清RPMI 1640. 将1 g pIRES2EGFPAIF1-400质粒DNA和2 L Lipofec

7、tAMINETM2000分别加于50 L无血清RPMI 1640中，轻轻振摇5 min，混匀，制成转染液，室温静置20 min后，将转染液逐滴加入爬片细胞中，轻轻混合，置37孵育6 h，弃去转染液，加含100 mL/L新生牛血清的RPMI 1640. 分别于转染后24，48和72 h取出玻片，用40 g/L多聚甲醛固定510 min后，于荧光显微镜下观察细胞形态. 对照组细胞转染pIRES2EGFP空载体，处理方法与实验组相同.1.2.4间接免疫荧光检测将HeLa细胞加至24孔板的玻片上，用脂质体法转染pcDNA3AIF1-400，同时转染pcDNA3AIF1-120作为阳性对照，pcDNA3

8、作为阴性对照，于转染后48 h取出爬片，用PBS(pH7. 4)洗3次，40 g/L多聚甲醛固定510 min，再经3 mL/L TritonX100穿膜处理后，依次加入1100的山羊抗人AIF蛋白的多克隆抗体和1100的FITC标记的兔抗山羊二抗. 以PBS洗后，将细胞爬片倒置于载玻片上于荧光显微镜下观察.            作者：张巍，张勇，孟艳玲，温伟红，薛茜，任君琳，杨安钢 【关键词】凋亡诱导因子；,HeLa细胞；,细胞凋亡Proapoptotic &#

9、160;       本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。1.2.5MTT法测定细胞存活率将HeLa细胞接种于96孔板中，脂质体法分别转染pcDNA3，pcDNA3AIF1-400. 每孔转染0.2 g质粒DNA，于37，50 mL/L CO2孵箱中培养，分别于转染后24，48，72和96 h进行MTT检测. 检测时每孔加入5 g/L MTT 20 L, 37孵育4 h后吸去培养液，每孔

10、加入150 L DMSO溶解结晶，各组均设4个复孔，检测样品的光吸收值，计算平均值，绘制生长曲线.    2结果 2.1AIF1-400的克隆及鉴定以pcDNA3AIF1-120质粒为模板，用引物zy1和zy2进行PCR，扩增出约为650 bp的片段（图1）,与预期大小一致，将该片段克隆入pcDNA3的相应位点，经EcoR和Xba双酶切鉴定，测序证实我们所获得的序列完全正确，命名为pcDNA3AIF1-400. 将测序正确的AIF1-400用EcoR和Sal双酶切后克隆入pIRES2EGFP相应位点，命名为pIRES2EGFPAIF1-400(图2).2

11、.2AIF1-400基因在HeLa细胞中的表达分别取pIRES2EGFPAIF1-400及pIRES2EGFP转染24，48和72 h后的细胞爬片荧光显微镜观察，瞬转后试验组与对照组相比，对照组生长状态良好，实验组细胞出现细胞形态变化，随转染时间延长，转染细胞数减少，荧光变弱（图3）.图3AIF1-400在HeLa细胞中的表达及转染后的HeLa细胞形态变化×2002.3间接免疫荧光检测转染pcDNA3组的细胞中，AIF呈点状分布，而转染pcDNA3AIF1-120及pcDNA3AIF1-400组的细胞中截短型AIF蛋白位于细胞质中，部分已经位于细胞核内（图4）.A: 13: pcDN

12、A3组; B: 13: pcDNA3AIF1-120组; C: 13: pcDNA3AIF1-400组.2.4AIF1-400基因对HeLa细胞增殖的影响pcDNA3AIF1-400转染后其基因的表达对细胞生长有明显的抑制作用（图）.3讨论细胞凋亡是所有多细胞生物所具有的一种基本特征，有重的生理意义. 目前普遍认为，caspases是介导细胞凋亡的主分子，但是在大部分应激诱导的哺乳动物凋亡模型中，caspases的抑制剂并不能完全阻止细胞凋亡的发生8-10. 近年来发现，有独立于caspases信号通路之外的另一条凋亡途径存在，即存在由AIF直接介导的细胞凋亡途径4-5，11-12. AIF在

13、多种组织中广泛分布，基因定位于X染色体上. AIF前体蛋白在细胞内合成后，通过其N末端的线粒体定位信号可有效地穿入线粒体膜间隙，然后在102位甘氨酸处水解掉MLS，其余部分再与黄素腺嘌呤二核苷酸结合，并重新折叠为具有促凋亡潜能的成熟AIF分子. 当凋亡信号刺激时，可检测到AIF分子从线粒体释放到细胞质，然后转位到细胞核内，直接导致核的早期凋亡形态变化，包括大片段DNA断裂的产生和初期的外周染色体的凝集1,13. 基因敲除实验发现，AIF小鼠胚胎期可致死. 在进一步体外模拟哺乳动物早期胚胎发生过程中发现，AIF的促凋亡活性是小鼠形态发生过程中胚体腔形成所必需的5, 而且该过程是AIF独立作用的结

14、果.以往的研究证实AIF1-1206及 AIF1-35213等截短分子均具有促凋亡活性. 我们的研究用PCR的方法扩增出了去除AIF基因线粒体定位信号FAD和NADH结合结构域（1400 aa）编码序列的AIF1-400基因，克隆入pcDNA3及pIRES2EGF的真核表达载体后，转染HeLa细胞.将pIRES2EGFPAIF1-400基因瞬转HeLa细胞后，出现细胞形态变化，随转染时间延长，转染细胞数减少，荧光变弱. 经间接免疫荧光检测可观察到截短型AIF蛋白位于细胞质中，部分已经位于细胞核内. 用MTT法检测发现AIF1-400转染后基因的表达对细胞生长有明显的抑制作用.AIF的致凋亡作用

15、不受caspases的抑制剂(如zVAD. fmk，IAP等)的抑制，也不受上游凋亡信号的控制，具有作为肿瘤杀伤分子特殊的优越性. 我们对AIF基因进行了改造，构建了AIF1-400基因，并初步证实人AIF基因去除线粒体定位信号，FAD和NADH结合结构域后仍具有促凋亡活性，与AIF基因相比，这种截短型AIF基因由于具有分子质量小的特征，更有利于应用.【参考文献】1Susin SA，Lorenao HK，Zamzami N，et al. Molecular characterization of mitoehondrial apoptosisinducing factorJ. Nature，1

16、999， 397(6718)： 441-446.2Daugus E，Susin SA，Zamzarm N，et al. Mitoehondrio-nuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosisJ. FASEB J，2000， 14(5)： 729-739.3Leofier M，Daugus E，Susin SA，et al. Dominant cell death induction by extramitochondrially targeted apoptosisinducing factorJ. FASEB J，2001，15

17、(3)：758-767.4Susin SA，Daugus E，Ravagnan L，et al. Two distinct pathways leading to nuclearapoptosisJ. J Exp Med，2000，192(4)：571-579.5Joza N，Susin SA，Daugus E，et al. Essential role of the mitochondrial apoptosisinducing factor in programed cell deathJ. Nature，2002，410(6828)：549-554.6于翠娟，盂艳玲，桂俊豪，等. 重组人

18、凋亡诱导因子基因的构建、表达及对HeLa细胞的促凋亡作用J. 生物化学与生物物理学进展，2002，29(6)：915-921.7Mate MJ，OrtizLombandia M，Boitel B，et al. The crystal structure of the mouse apoptosisinducing factor AIFJ. Nat Struct Biol，2002，9(6)：42-46.8McCarthy NJ，Whyle MK，Gilbert CS，et al. Inhibition of Ced3ICErelated protease does not prevent ce

19、l death induced hy oncogenes，DNA damage，or the Bcl2 homologue BakJ. J Cell Biol，1997，136(1)：215-227.9Deas O， Dumont C， MacFarlane M，et al. Caspases independent cell death induced by antiCD2 or staurosporine in activated human peripheral T lymphocytesJ. J Immunol，1998，161(7)： 3375-3383.10Do

20、ng Z，Saikumar P，Griess GA，et al. Intracellular Ca2 thresholds that determine survival or death of energydeprived cellsJ. Am J Pathol，1998，152(1)：231-240.            作者：张巍，张勇，孟艳玲，温伟红，薛茜，任君琳，杨安钢 【关键词】凋亡诱导因子；,HeLa细胞；,细胞凋亡Proapoptotic