亚低温对脑缺血区P53蛋白表达的影响

1、    亚低温对脑缺血区P53蛋白表达的影响        摘要目的在尿激酶溶解大鼠脑血栓治疗中，研究亚低温对溶栓复流后大脑中动脉缺血区P53蛋白表达的影响。方法应用肾血管性高血压大鼠(RHRSP)，用光化学法制成一侧大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，在血栓形成后0.5h应用尿激酶静脉溶栓复流后，用免疫组织化学的方法研究P53蛋白的表达。结果亚低温组P53蛋白的表达，明显弱于正常体温组。结论亚低温降低脑缺血区域的P53蛋白的表达，可能是亚低温产生脑保护的机制之一。关键词脑缺血溶

2、栓治疗亚低温P53蛋白 To study the effects of mild hypothermia (MH) on expression of P53 protein in ischemic brain of ratPeng Fuhua,Su Zhenpei,Li Ling,et al(Department of Neurology,The Third Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Science,Guangzhou 510630.)AbstractObjetiveTo observe whether mild

3、 hypothermia (MH) affected the expression of P53 protein in ischemic brain of rat.MethodsMiddle cerebral artery occlusion(MCAO) induced by photochemical method in renovascular hypertensive stroke-prone rats(RHRSP).At 0.5 hour after the thrombotic occlusion of MCAO,urokinase (UK) were administered in

4、travenous infusion.The expression of P53 protein was assessed by using immunohistochemical method.ResultThe expression of P53 protein reduced in MH group.ConclusionMH may play a role in protection of ischemia neurons by reducing expression of P53 protein.Key wordsCerebral ischemiaThrombolysisMild hy

5、pothermiaP53 protein1材料与方法1.1实验动物选用纯种健康雄性SD大鼠30只，体重90120g，鼠龄23个月。大鼠均行双肾双夹肾动脉狭窄术1，术前3d每日用尾筒法测量血压1次。MAO前，光化学MCAO制作及亚低温治疗过程中，用生理三仪器监测股动脉血压情况。1.2RHRSP进行光化学法MCAO模型复制2双肾动脉狭窄术后高血压持续810周以上，血压达24kPa或以上，从未出现脑卒中神经系统症状的RHRSP，用3%戊巴比妥钠3540mg/kg腹腔麻醉，经左侧颞部入路，在颧弓与颞鳞骨接合处的前端2mm处用牙科钻作一直径为5mm的骨窗，透过硬脑膜，可清楚看到左侧MCA近段跨过嗅束处。

6、经股静脉注射3%玫瑰红B(30mg/kg体重)后，用Nd-YAG激光器发出的激光(波长320nm，光斑直径3mm，功率0.3W)持续照射MCA主干近端及跨嗅束段10min。注射尿激酶后90min用手术显微镜观察MCA血管再通情况后，缝合切口。对照组大鼠开颅后，股静脉注射3%玫瑰红B，不用激光照射。1.3亚低温实施方法在24环境中，大鼠麻醉后，取仰卧位固定，用冰袋覆盖其体表暴露部位，冰量按100g/100mg体重，诱导时间控制在10min，亚低温温度维持在3234，维持时间为3h，自然复温。采用上海产WM-03型电子温度计，以直肠温度代表全身深部体温。1.4正常体温和亚低温溶栓治疗的研究尿激酶用

7、量为6万U/kg体重计算，MCAO术后从股静脉推注，用3ml生理盐水配制，先静脉快速推注1/3，其余15min推注完毕，正常体温组为MCAO后0.5h行溶栓治疗。亚低温组为MCAO后0.5h同时进行亚低温和溶栓治疗。正常体温组和亚低温组各12只大鼠。1.5P53蛋白的免疫组织化学方法和强度分析行P53蛋白检查的正常体温对照组和亚低温组大鼠经历MCAO术后30min从股静脉注射尿激酶溶栓复流。应用ABC免疫组织化学方法。P53抗体是来自基因公司的单克隆抗体(Pab240)，阻断血清及、抗体采用博士生物工程有限公司的试剂盒。免疫组化染色强度结果分析采用Optimas 5.0,像分析系统取高倍镜下选

8、缺血侧皮层区5个典型视野，以阳性单位表示P53表达强度3。1.6统计处理采用spss统计软件对数据进行处理，所有计量资料数据用±s表示，两样本均数比较采用t检验。2结果2.1RHRSP模型和光化学法MCAO模型30只SD大鼠用双肾双夹肾动脉狭窄术复制成RHRSP。术前血压为12.95±2.51kPa,术后7 d开始血压明显上升，平均19.43 ± 3.56kPa,术后3周25.84±3.63kPa。10周血压30.16±4.47kPa。在暴露MCA手术过程中，损伤出血死亡4只，其余26只成功复制成左侧MCA主干血栓形成模型。大鼠股静脉注射玫瑰红

9、B后，在激光束下，通过滤光片，可以看到MCA呈桔红色，随着激光的照射，颜色呈黄色，MCA完全闭塞，颜色呈白色。溶栓复流后，用手术显微镜能观察到血管再通。正常体温组溶栓复流率58.33%(7/12)，亚低温组的溶栓复流率为75.00%(9/12)。2.2病理组织学表现和P53蛋白的表达对照组及无缺血的大脑半球未见变异型P53蛋白的表达。通过HE染色，观察到溶栓复流后的脑梗塞灶比MCA未再通的小。溶栓复流后，HE染色见脑缺血灶有红色神经元、残骸神经元，周边可见黑色神经元。免疫组织化学染色发现P53蛋白表达主要在缺血灶中心的死亡细胞，大脑皮层的P53蛋白染色比基底节区深，在缺血灶周围形态完整的细胞P

10、53蛋白染色很弱。2.3亚低温对缺血区P53蛋白表达的影响溶栓复流的大鼠在MCAO后24h处死，选择相同部位大脑皮层的P53蛋白表达强度作象分析，正常体温组的阳性单位为46.73±7.78，亚低温组的阳性单位为38.62±8.37，亚低温组P53蛋白的表达，明显弱于正常体温组的表达(P<0.05)。3讨论脑缺血后神经细胞迟发性死亡参与梗塞灶形成，迟发性神经元死亡主要机制为细胞凋亡4。目前研究发现，与细胞凋亡紧密相关的基因Bcl-2、P53、ICE等都参与了迟发性神经元死亡的发生5。P53基因有野生型(wt-P53)和突变型(m-P53)，正常细胞中存在wt-P53及其

11、蛋白，可通过抑制细胞增殖或激活其它基因抑制细胞增殖循环，从而使损伤细胞在分裂前有足够的时间修复。在外界一些因素作用下，wt-P53发生突变，m-P53对细胞无保护作用6。Crumrine等7利用转基因技术，观察P53基因对脑缺血后梗塞灶大小的影响，发现使用带有无效的P53基因的转基因鼠，在MCA结扎后，其梗塞面积比带有野生型P53基因鼠降低15%，发现降低P53基因表达，脑缺血后神经元死亡数目减少。在细胞凋亡过程中，P53基因是一种致死基因，诱导细胞凋亡，P53蛋白被认为是导致细胞凋亡机制中的主要因子，脑缺血能诱导P53基因的表达4，8。P53基因不仅参与了死亡性损伤，而且其作用可能与启动程序

12、性死亡有关5。亚低温已证实不仅能抑制急性缺血细胞的坏死，而且能减少以细胞凋亡为主要机制的缺血后迟发性细胞损害。我们采用免疫组化的方法，对光化学诱导MCAO溶栓复流后，研究亚低温组和正常体温组脑缺血区域变异性P53蛋白的表达，结果表明，在非缺血侧大脑半球未见P53蛋白的表达,而缺血侧大脑半球正常体温组P53蛋白表达明显强于亚低温组，说明亚低温能降低P53的表达。亚低温降低P53蛋白表达的机制不清楚，结合文献，可能与以下因素有关：(1)现在已有报道9，亚低温能影响早期反应基因表达，因此，亚低温也可能直接影响P53基因的表达，从而达到P53蛋白表达降低。(2)脑缺血后和再灌注能诱导P53基因的表达4

13、，8。而亚低温能减少缺血和再灌注后有害物质释放，因此，亚低温可能减弱P53基因的表达。(3)亚低温减少Ca2+内流，调节调钙蛋白激酶活性，因而亚低温可能影响P53蛋白的合成过程。迟发性神经元死亡的主要机制是细胞调亡。在细胞凋亡中，P53是一种死亡基因，诱导细胞凋亡的发生，导致神经元迟发性死亡。我们实验结果表明，亚低温组的P53蛋白表达低于正常体温组，提示亚低温可能通过降低突变型P53蛋白来减少神经细胞死亡。作者单位：彭福华(510630广州 中山医科大学附属三院)苏镇培李玲曾进胜裴中(中山医科大学附属一院)参考文献1 黄如训，曾进胜，苏镇培，等.易卒中型肾血管性高血压大鼠模型.中国神经精神疾病

14、杂志，1991，17(5)：257.2 Brant D,Watson W,Dalton D,et al.Argon laser induced arterial photothrombosis.J Neursurg,1987,66:748.3 申洪.免疫组织化学染色定量方法研究().中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4(1)：89.4 Li Y,Chopp M,Powers C,et al.Apotosis and protein expression after focal cerebral ischemia in rat.Brain Res,1997,765(2):301.5 卫国，张

15、均田.缺血性脑损伤与程序性死亡.生理科学进展，1998，29(1)：45.6 Kern SE,Pietenpol JA,Thiagalingam S,et al.Oncogenic forms of P53 inhibit P53-regulated gene expression.Science,1992,256:827.7 Crumrine RC,Thomas AL,Morgan PF.Attenution of P53 expression protects against focal ischemic damage in transgenic mice.J Cereb blood Flow Metab,1994,14(6):887.8 Li Y,Chopp M,Zheng G,et al.P53-Immunoreactive protein and P53 mRNA expression after transient middle cerebral artery occlusion in rats.Stroke,