实时定量PCR分析小鼠树突状细胞TLR4 mRNA表达及地塞米松的调节

1、实时定量PCR分析小鼠树突状细胞TLR4 mRNA表达及地塞米松的调节                  作者：张罕, 吕?, 李冬妹, 何秀娟, 伍香玲, 胡永秀 【摘要】  目的: 建立检测小鼠Toll样受体4（TLR4）mRNA表达水平的SYBR Green实时定量PCR实验; 观察小鼠骨髓源树突状细胞（DC）发育成熟过程当中TLR4 mRNA表达水平的动态变化以及地塞米松（DEX）对DC TLR4 mRNA表

2、达的影响。方法: （1）用细胞因子定向诱导的方法将小鼠骨髓细胞培养为DC; （2）构建pUCm?T/TLR4和pUCm?T/?actin重组质粒, 建立检测小鼠TLR4 mRNA水平的实时定量PCR实验; （3）用实时定量PCR技术对体外培养4、 6、 8、 10、 12 d的DC TLR4 mRNA表达水平进行动态观察; （4）在DC培养体系中加入DEX, 与常规培养DC TLR4 mRNA表达水平进行比较。结果: （1）从小鼠骨髓细胞中成功诱导培养了DC, 经免疫磁珠纯化后其纯度可达90%以上; （2）建立了能精确分析小鼠TLR4 mRNA表达水平的SYBR Green实时定量PCR实验;

3、 （3）在DC培养前期TLR4 mRNA表达水平变化不大, 后期则明显升高; （4）DEX可使DC TLR4 mRNA表达增强。结论: 小鼠骨髓源DC TLR4 mRNA表达水平与其发育成熟阶段密切相关; DEX促进DC TLR4 mRNA表达。 【关键词】  实时定量PCR 树突状细胞 TLR4 地塞米松 Abstract  AIM: To establish a SYBR Green quantitative real?time PCR method for detecting the expression of the TLR4 mRNA of mice and to

4、 monitor the dynamics for TLR4 mRNA level of mice bone marrow?derived dendritic cells (DC) in the process of the maturation and the effect of dexamethasone (DEX) on TLR4 expression. METHODS: (1) DC from mice bone marrow were induced by cytokines and separated by magnetic beads. (2) The combined plas

5、mid pUCm?T/TLR4 and pUCm?T/?actin for the standard materials in the real?time PCR was reconstructed. (3) The dynamics for the express TLR4 mRNA of DC cultivated in vitro for 4, 6, 8, 10, 12 days was detected respectively. (4) The TLR4 mRNA expression between DC treated with or without DEX was detect

6、ed and compared. RESULTS: (1) The DC with the purity over 90% were fully separated in success. (2) A SYBR Greenquantitative real?time PCR method for analyzing the TLR4 mRNA expression level of the mice was successful established. (3) TLR4 mRNA level was stable early during the culture of DC and then

7、 rise obviously at last. CONCLUSION: There exists a close relationship between the level of TLR4 mRNA and the period of maturation of DC and the expression of TLR4 could be increased by DEX.    Keywordsreal?time PCR; dendritic cells; toll like receptor?4; dexamethasone Toll样受体（to

8、ll like receptors, TLR）是一类重要的模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR）, 现已确认的人类TLR家族成员有11个（TLR1TLR11）, 其中发现最早和功能相对比较清楚的是TLR4。TLR4主要存在于巨噬细胞、 中性粒细胞以及树突状细胞（dendritic cells, DC）表面, 可接受G-菌脂多糖（LPS）的刺激而活化, 进而通过一系胞内信号转导过程, 最终使转录因子NF?B活化, 启动多种与炎症反应相关的基因转录。近年, 对于TLR4与DC发育成熟的关系以及TLR4介导的信号转导通路的研究逐渐受到关注, 人们意识到DC

9、的功能状态很可能与TLR4所介导的信号转导有密切联系, 机体由于多种原因使TLR4表达下降或者上升, 其结果均可影响DC的成熟状态, 从而影响机体的免疫状况1。地塞米松（dexamethasone, DEX）目前已证实该药能够在免疫应答的各个环节发挥抑制效应, 其中包括抑制DC的抗原提呈能力和DC的分化2。DEX能否通过阻断TLR4信号转导途径来影响DC的成熟,从而影响抗原的提呈？ 目前还没有定论。SYBR Green real?time PCR是PCR定量技术中的一种, 可以对基因扩增的起始模板的拷贝数进行精确定量, 还可以通过熔解曲线判断扩增产物的特异性, 是一种灵敏度高、 特异性好的检测

10、技术。我们应用SYBR Green real?time PCR技术, 建立了检测小鼠TLR4 mRNA表达水平的实时定量PCR实验, 进而观察了在DC的发育成熟过程当中TLR4 mRNA表达水平的动态变化, 以及DEX对DC TLR4 mRNA表达的影响。 1  材料和方法 1.1  材料  C57BL/6小鼠（68周龄, 雌性, 体质量1820 g）, 购自北京军事医学科学院动物中心。SYBR Green I荧光定量试剂盒购自北京东胜创新实验技术公司。实时定量采用美国Bio?rad公司Chromo 4TMReal?time PCR仪, 配有该公司（原MJ公司）O

11、pticon Monitor 3荧光定量分析软件。细胞因子rmGM?CSF及rmIL?4为美国Peprotech公司产品。CD11C+细胞磁珠分离纯化试剂盒为德国Milentyi公司产品。MMLV反转录试剂盒、 PCR试剂盒、 胶回收试剂盒、 pUCm?T载体连接试剂盒均购自上海生物工程技术服务公司。大肠杆菌DH5感受态细胞购自北京博大泰克生物基因技术公司。质粒抽提试剂盒购自北京Tigen公司。DEX为天津药业焦作有限公司生产。PCR引物合成和质粒测序由上海生物工程技术服务公司完成。 1.2  方法 1.2.1  小鼠骨髓源DC的培养及纯化  （1）小鼠骨髓源DC

12、的培养: 采用细胞因子GM?CSF和IL?4联合诱导小鼠骨髓细胞向DC定向分化, 方法简述如下: 收集C57BL/6小鼠股骨骨髓细胞, Tris?NH4Cl缓冲液裂解红细胞, RPMI1640液洗涤2次后重悬细胞, 调整其密度为1×109/L,置于6孔培养板内, 37、 50 mL/L CO2、 饱和湿度下贴壁3 h。吸弃上清液, 用37预温的RPMI1640液轻轻洗去非贴壁细胞, 每孔加入含100 mL/L胎牛血清、 10 g/L rmGM?CSF、 2 g/L rmIL?4的RPMI1640完全培养液2 mL继续培养, 隔日半量换液, 培养结束后通过反复吹吸收集疏松黏附细胞及悬浮

13、细胞。（2）DC的纯化与鉴定: 应用德国Milentyi公司生产的CD11C+细胞磁珠分离试剂盒, 按试剂说明书操作, 对培养DC进行纯化。采用PE标记的仓鼠抗小鼠CD11c mAb, 通过流式细胞术（FCM）分析纯化前后的DC纯度。    1.2.2  重组质粒pUCm?T/TLR4和pUCm?T/?actin的构建  应用RT?PCR技术分别从小鼠DC和脾细胞中获得TLR4和?actin基因片段, 与pUCm?T载体连接,构建重组质粒pUCm?T/TLR4和pUCm?T/?actin, 作为real?time PCR实验的定量模板

14、。（1）TLR4和?actin基因片段的制备: 每5×106个DC（或脾细胞）中加入1 mL TRIzol裂解细胞, 氯仿?异丙醇法常规提取总RNA, 通过紫外分光光度计测量A260/280的比值, 确定RNA的纯度和浓度。采用MMLV反转录试剂盒合成cDNA, 以cDNA为模板进行PCR反应。TLR4引物、 扩增条件及扩增片段长度如下: 上游引物: 5?GCT TTC ACC TCT GCC TTC AC, 下游引物: 5?CGA GGC TTT TCC ATC CAA TA; 扩增条件: 94变性30 s, 60退火30 s, 72延伸30 s, 共30个循环; 扩增片段为359

15、 bp。?actin引物、 扩增条件及扩增片段长度为: 上游引物: 5?TGG AAT CCT GTG GCA TCC A, 下游引物: 5?TAA CAG TCC GCC TAG AAG CA; 扩增条件: 94变性30 s, 62退火30 s, 72延伸30 s; 共30个循环; 扩增片段为334 bp。通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定, 然后在紫外灯下切下目的基因条带, 用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收, 即获得纯化的TLR4和?actin基因片段。（2）重组质粒的连接、 转化、 阳性克隆筛选及鉴定: 将pUCm?T载体分别与TLR4和?actin基因片段以适当比例（摩尔比

16、13110）进行连接, 连接反应时间为4 h。连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞, 采用蓝白斑初次筛选和菌落PCR再次筛选的方法确定阳性菌落, 在氨苄青霉素抗性LB培养液中扩增阳性菌落, 然后从菌液中提取质粒进行测序鉴定。 1.2.3  SYBR Green I real?time PCR检测方法的建立  （1）标准曲线绘制: 分别提取重组质粒pUCm?T/TLR4和pUCm?T/?actin, 通过紫外分光光度计测量质粒的A260值, 根据Mr和阿佛加德罗常数计算出分子拷贝数,将重组质粒（即real?time PCR反应的标准品）稀释成1010、 109、 108、 1

17、07、 106、 105、 104拷贝/mL。Real?time PCR反应的总体系为20 L, 其中包括上、 下游引物各1 L（引物序列同前）, 重组质粒模板4 L, 2×QT master mix 10 L（含有Taq DNA聚合酶、 dNTP、 SYBR Green染料等成分）。pUCm?T/TLR4的最佳反应条件是: 95预变性 15 min后进入循环, 94变性30 s, 60退火30 s, 72延伸30 s, 共30个循环。读板温度是78。pUCm?T/?actin的最佳反应条件是退火温度为62, 其余数据同pUCm?T/TLR4。荧光域值的设置为315个循环左右的荧光信

18、号强度标准偏差的10倍。循环结束后, Opticon Monitor 3荧光定量分析软件自动绘制扩增动力曲线和回归曲线。（2）Real?time PCR反应的特异性分析: 通过熔解曲线分析real?time PCR反应产物的纯度以判断实验的特异性。熔解曲线测定的方法是将real?time PCR产物从60缓慢而均匀地升温至95, 温度每升高0.2读1次荧光值, 由Opticon Monitor 3荧光定量分析软件自动绘制熔解曲线。（3）Real?time PCR反应的稳定性分析: pUCm?T/TLR4和pUCm?T/?actin分别于不同的时间点进行4次real?time PCR反应, 计算

19、高拷贝数下（1010 copy/mL）和低拷贝数下（104 copy/mL）的变异系数, 分析实验的可重复性。    1.2.4  小鼠DC TLR4 mRNA表达水平的检测  （1）培养不同时期的小鼠DC TLR4 mRNA表达水平的动态变化: 小鼠骨髓源DC培养方法同1.2.1。在DC培养的第4、 6、 8、 10、 12 天分别收集细胞,通过免疫磁珠法得到纯化的DC细胞, 按前述方法提取总RNA, 反转录得到cDNA。将梯度稀释的pUCm?T/TLR4与待测DC cDNA样品同时进行real?time PCR反应, 利用标准曲线

20、计算样品中TLR4 cDNA的精确拷贝数。为了避免由于起始细胞数目不同而引起的差异, 选用了外参?actin作为对照, 最后的结果用TLR4的起始拷贝数/?actin的起始拷贝数（设为K）来表示。（2）DEX对小鼠DC TLR4 mRNA表达水平的影响: DC培养时分成2组, 一组按前述方法常规培养,    另一组在细胞培养体系中加入DEX, 使药物的终浓度为10-7 mol/L。于第6天分别收集两组细胞, real?time PCR检测方法同上。 1.2.5  统计学处理  应用SPSS Ver.11.5软件, 样本比较采用独立样本的秩和检验

21、, 取P<0.05为有统计学意义。 2  结果 2.1  小鼠骨髓源DC纯度鉴定  FCM检测结果显示, 用免疫磁珠法纯化后, CD11C细胞阳性率可达到90%以上, 表明DC纯度完全可以满足下一步实验的需要（图1）。 图1  DC纯度的FCM鉴定（略） Fig 1  Identification of the DCs purity with FCM a: The isotype antibody control; b:The rate of DCs without purication; c: The rate of DCs separ

22、ated with Microbeads. 2.2  SYBR Green实时定量PCR检测方法的建立 2.2.1  重组质粒pUCm?T/TLR4和pUCm?T/?actin的构建  琼脂糖凝胶电泳结果显示, RT?PCR产物符合TLR4和?actin基因片段的预期大小（分别为359 bp和334 bp）（图2）。将RT?PCR产物与pUCm?T载体连接后, 测序结果显示TLR4和?actin基因片段已插入pUCm?T 载体中, 表明重组质粒pUCm?T/TLR4和pUCm?T/?actin构建成功。 图2  琼脂糖凝胶电泳检测TLR4和?actin

23、RT?PCR产物（略） Fig 2  Agarose gel electrophoresis analysis of RT?PCR product of TLR4 and ?actin 1: TLR4; 2: ?actin; M: DNA markers. 2.2.2  标准曲线  以重组质粒pUCm?T/TLR4和pUCm?T/?actin作为模板进行real?time PCR反应。从扩增动力曲线和回归曲线可以看出, 荧光信号的强度和2种质粒的初始拷贝数有良好的线形关系, 相关系数r2>0.99, 线形范围从1041010（图3）。  

24、  图3  pUCm?T/TLR4的扩增动力曲线（a）和回归曲线（b）（略）Fig 3  The dynamical curve(a) and the regression curve(b) for pUCm?T/TLR4 amplication. The template was a dilution series of ranging from 104 to 1010 copies per reaction. Standard curve plot of log copy number vs. C(t) value. 2.2.3  熔解曲线

25、  熔解曲线峰比较单一, 没有杂峰, 无非特异性信号干扰, 表明real?time PCR产物纯度较高, 反应具有良好的特异性（图4）。 图4  pUCm?T/TLR4扩增产物的熔解曲线（略） Fig 4  The melting curve of the reconstruct plasmid pUCm?T/TLR4 in the real?time PCR 2.2.4  Real?time PCR反应的稳定性分析  重组质粒pUCm?T/TLR4和pUCm?T/?actin在高拷贝数下（1010 copy/mL）和低拷贝数下（104 cop

26、y/mL）进行real?time PCR检测的变异系数（CV）在13%以内, 表明实验有较好的稳定性（表1）。 表1  pUCm?T/TLR4和pUCm?T/?actin检测的批间差异（略） Tab 1  The repetition of amplication for pUCm?T/TLR4 and pUCm?T/?actin 2.3  小鼠DC TLR4 mRNA表达水平的检测 2.3.1  培养不同时间的小鼠DC TLR4 mRNA表达水平的动态变化  体外诱导培养第2、 4、 6、 8、 10、 12天的DC TLR4 mRNA 17

27、.0±2.9、 35.0±9.4表达水平(K值)分别为58.1±12.4、 33.9±7.8、 12.4±0.7以及1477.5±484.2。 经统计学处理, 12 d与其余各时间点之间差异有统计学意义（P<0.01）。 2.3.2  DEX对小鼠DC TLR4 mRNA表达水平的影响  加入DEX培养的DC和常规培养的DC相比, 前者的K值（134.50±19.94）约为后者的10倍（13.22±1.41）, 差异有统计学意义（P<0.05）, 表明DEX能够促进DC TLR4 m

28、RNA的表达。 3  讨论    根据化学原理的不同, 荧光定量PCR技术可分为2种, 即探针类和非探针类定量法, 前者的代表性技术是Taq Man探针法, 后者是SYBR Green荧光染料法。Taq Man探针法灵敏度相对较高, 但是操作相对复杂, 对探针的设计、 实验条件要求也相对严格, 实验成本较高, 通用性较差, 限制了其应用; SYBR Green荧光染料法操作相对简单, 造价也相对便宜, 但有时可能存在非特异性信号的干扰。如能选取合适的标准品制备标准曲线并优化反应条件, 则可使其成为灵敏、 特异而又简便实用的基因定量检测方法。理想的高纯度标

29、准品是SYBR Green PCR技术成功的关键。我们采用基因克隆技术, 构建了pUCm?T/TLR4和pUCm?T/?actin重组质粒作为标准品, 实验结果显示, 重组质粒的拷贝数和CT值具有良好的线形关系, 且熔解曲线峰相对单一, 无杂峰, 可以有效的排除非特异性信号的干扰。表明我们已成功建立了检测小鼠TLR4 mRNA表达水平的SYBR Green实时定量PCR实验。        DC表面的TLR4能够识别外来抗原中较为保守的分子结构, 进而通过一系列信号转导途径引起转录因子NF?B的激活3。多种细胞因子, 如IL

30、?4和巨噬细胞移动抑制因子（MIF）等均可影响TLR4的表达4。另外, 其存在形式也不是单一的, 在细胞膜的表面和高尔基体中均存在TLR4的表达, 后者可以在机体需要的时候迁移到膜表面发挥作用。本实验中, 我们采用细胞因子联合定向诱导的方法在体外大规模培养DC, 并通过免疫磁珠纯化法获得高纯度的DC, 为下一步的研究打下了坚实的基础。然后我们应用SYBR Green real?time PCR精确分析不同发育时期DC TLR4 mRNA表达水平, 结果显示, DC培养早期（46 d）K值呈轻度下降趋势, 中期（610 d）K值基本稳定, 而后期（12 d）K值明显升高（P<0.01）。这

31、种变化的机制目前还不十分清楚。    在以往的研究中, 我们观察到在DC培养体系中加入DEX后, 可使其成为能抵抗LPS刺激的未成熟DC, 即“耐受原DC”5。由于LPS是通过TLR4介导的信号转导通路发挥作用的, 所以我们设想DEX可能对TLR4的表达及其介导的信号转导通路有一定影响。令我们感兴趣的是, 在加入DEX以后, TLR4表达量不降反升, 其机制是什么？ 值得进一步探讨。近年来的研究显示, DEX对免疫应答反应起双向调节作用,  且与细胞的功能状态有关。例如, DEX类药物可诱导静息状态的T细胞表达TLR4, 却抑制活化T细胞TLR4的表达6

32、。又如, 在严重感染或休克状态下, DEX可下调巨噬细胞TLR4表达, 并藉此抑制NF?B活化后炎性细胞因子的分泌; 但对哮喘模型鼠的巨噬细胞或肺组织TLR4表达却起上调作用7。这些实验结果提示DEX的免疫调节作用具有选择性。有关DEX对体外诱导培养的未成熟DC TLR4表达的影响, 迄今还未见报道。我们分析, 由于DEX使DC停留在发育的早期阶段（大约相当于本实验中体外诱导培养24 d的DC）, TLR4的表达亦处于相对较高的水平; 此类未成熟DC具有耐受原性, 可诱导调节性T细胞的产生8。我们相信, 随着对DEX、 DC和TLR4关系的研究逐渐深入, 一定能更清晰地解释DEX促进DC TLR4表达的机制。 【参考文献】  1 Kitamura H, Morikawa H, Kamon H, et al. Toll?like receptor?mediated regulation of zinc homeostasis influences dendritic cell functio