定量测定IL-4和IFN-γmRNA的RT-竞争PCR法及其应用

1、    定量测定IL-4和IFN- mRNA的 RT-竞争PCR法及其应用        【 摘要 】目的建立测定IFN- mRNA和IL-4 mRNA和RT-竞争PCR方法，探讨体外诱生条件并作临床初步应用。 方法用自行设计和制备的IFN- cDNA和IL-4 cDNA竞争模板，作RT-竞争PCR，对健康人经PMA和calcium ionophore(钙离子载体)诱导的PBMC、11例健康人和13例哮喘患者PBMC作IFN- mRNA和IL-4 mRNA

2、定量测定。 结果在建立了准确的定量测定mRNA方法的基础上，确认在calcium ionophore 2.0mol/L浓度时，用PMA 100ng/ml诱导6?h或PMA 80ng/ml诱导7?h，IFN- mRNA或IL-4 mRNA表达分别达最高水平，两种细胞因子mRNA在健康人PBMC中不表达，而在10/13例和11/13例哮喘患者中分别呈不同程度的表达，其中IL-4 mRNA表达水平高于IFN- mRNA。 结论用自行设计和制备的竞争模板经RT-竞争PCR法可对细胞内IFN- mRNA和IL-4 mRNA作较准确的定量测定，方法简便且敏感；健康人PBMC需经一定条件刺激方可表达两种细胞

3、因子mRNA；多数哮喘患者PBMC不经刺激即可表达两种细胞因子mRNA,IL-4 mRNA表达水平高于IFN- mRNA，提示本法可用于研究细胞因子基因表达和哮喘等患者细胞因子变化动态。【 主题词 】白细胞介素4；干扰素；mRNA；逆转录多聚酶链反应；竞争模板 A competitive RT-PCR method for quantitative determination of IFN- mRNA and IL-4 mRNA and its applicationZHU Qinghui, ZHANG Hongxi, SUN Bixiong, et al.(Immunology and Mo

4、lecular Biology Laboratory of Respiratory Field, First Hospital of Shanghai Textile, 200060 Shanghai, P. R. China)【 Abstract 】ObjectiveTo establish a competitive RT-PCR method for quantitative determination of IFN- mRNA and IL-4 mRNA and explore the optimal inductive condition in vitro. MethodsIFN-

5、mRNA and IL-4 mRNA in PBMC induced by PMA and calcium ionophore of a healthy volunteer (HV) and in unstimulated PBMC of 11 HVs and 13 asthma patients were determined quantitatively with the established competitive RT-PCR method using self-prepared internal standard as competitive templets. ResultsA

6、simple, sensitive and accurate method for quantitatively determining cytokine mRNA has been established in the HVs PBMC stimulated with calcium ionophore 2.0mol/L, and PMA 100ng/ml harvested at 6?h or PMA 80ng/ml harvested at 7?h, expression of IFN- mRNA or IL-4 mRNA reached the highest level respec

7、tively. In the HVs unstimulated PBMC, the expression of mRNA of the two cytokines could not be detected. In unstimulated PBMC from ten and eleven of the thirteen asthma patients, IFN- mRNA and IL-4 mRNA were expressed in various level, the former was lower. ConclusionThe method was simple, sensitive

8、 and accurate, HVs PBMC, only stimulated, expressed mRNA of the two cytokines, but unstimulated PBMC from most asthma patients expressed IFN- mRNA and IL-4 mRNA, the former was lower. The method could be applied in exploring cytokine gene expression and monitoring the change of cytokine mRNA in PBMC

9、 of patients.【 Subject words 】Competitive templet; IFN-; IL-4; mRNA; RT-PCR检测细胞因子最早使用生物学或免疫学测定法，这两类检测可反映某种细胞因子分泌、吸附、消耗和降解后的净含量1，但不能为细胞因子产生过程中基因转录、翻译及翻译后调控机制提供必要的信息，也不能反映细胞或组织内细胞因子基因表达水平。分子生物学技术的应用为此类研究提供了较为理想的途径2，其中RT-PCR方法尤其适合于极微量的标本或低水平表达的标本3。细胞因子的基因表达过程中mRNA的合成远先于分泌的蛋白产物，对临床具有早期诊断参考价值。为此，我们以自行设计和

10、制备的内标准品作为竞争模板，用RT-竞争PCR对IL-4和IFN- mRNA作为定量测定，用以研究健康人PBMC经诱导后两种细胞因子表达的动态，对比检测健康人和哮喘患者PBMC中的表达水平，探讨其临床意义，兹将结果报告如下。材料和方法受检样品：健康人11名，均为献血员，年龄3050岁，平均41.2岁；临床确诊的哮喘患者13名，年龄3555岁，平均44.9岁，男2例，女11例，平均哮喘史24.6年，轻度4例，中度4例，重度5例。采取严格的防止RNA酶污染的措施采集24份EDTA-Na2抗凝血，分离单个核细胞，-80冻存。试剂和仪器：PMA(Phorbol 12-myristate 13-acet

11、ate)、calcium ionophore (钙离子载体，Sigma)、琼脂糖(FMC)，RPMI 1640培养液(GIBCO)，Taq DNA多聚酶、AMV逆转录酶和dNTP(Promega), RNasin(华美生物工程公司)，DEPC(SERVA)，RNA提取试剂盒(Boehringer Mannheim), DNA回收试剂盒(上海华顺公司), oligo-dT(中科院上海细胞生物学研究所合成)，淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，RNA/DNA calculator(Phamacia Biotech公司)，DNA扩增仪(minicyclet MJ-150 Reserch公司)，像处理系统

12、(SX-100 image system，上海四星生物技术有限公司)。引物16依据文献4的原理由计算机辅助设计，引物7、8按文献5，合成单位同oligo-dT。IFN-：引物1(P1)5-TTTTGGGTTCTCTTGGCTGTT-3，引物2(P2)5-CTCCTTTTTCGCTTCCCTGT-3，引物3(P3)5-CTCCTTTTTCGCTTCCCTGTGCCATCACTTGGATGAGTTC-3。IL-4：引物4(P4)5-AATTGCCTCACATTGTCACT-3，引物5 (P5)5-CTCTCATGATCGTCTTTAGCC-3，引物6(P6)5-CTCTCATGATCGTCTTTA

13、GCCTACTCTGGTTGGCTTCCTTC-3。-actin5：引物7(P7)5CGCGAGAAGGTGACCCAGATC-3，引物8(P8)5-ATCACGATGCCAGTGGTACGG-3。方法(全部实验过程均严格防止RNA酶污染)用于IFN-和IL-4 cDNA扩增的竞争模板的制备：取健康人按常规无菌分离外周血单个核细胞(PBMC，细胞浓度2×106/ml)，分别加入2.0mol/L的calcium ionophone和不同浓度的PMA，用RPMI 1640完全培养液置37、5% CO2分别温育不同时间，以诱生IL-4 mRNA和IFN- mRNA,温育后离心，收集PBMC

14、，用同一批提取液于同一天按试剂盒说明书提取总RNA，在RNA/DNA calculator上测定含量和纯度，取总RNA 1.5g,oligo-dT(300pmol/l)0.5l,dNTP(2.5mmol/L)1l,RNasin(40U/l)0.5l,AMV逆转录酶(9U/l)0.5l，5×AMV buffer 2l,以DEPC水补足至10l作RT(42 30?min,95 4?min,45?min);PCR：取上述RT产物(cDNA)3l,20pmol/l的P1、P3(或P4、P6)各1l，dNTP 2l,Taq酶0.5l(5U/l)，DD-H2O 12.5l，95 60?s,664

15、0?s,72 45?s循环28次，72 5?min,扩增IFN- cDNA内标准品(或94 45?s,55 45?s,72 45?s,循环30次，72 5?min，扩增IL-4 cDNA内标准品)，产物经3%琼脂糖电泳，于紫外分析仪下切割目的条带，按试剂盒说明操作回收内标准品，测定含量，分别以P1和P2(或P4和P5)为引物复作PCR，确定内标准品的合适用量，分装后作为竞争模板-80冻存。IFN-和IL-4 mRNA的定量测定：取测定样本，用同一批提取液于同一天提取PBMC总RNA，在RNA/DNA calculator上测定含量和纯度，A260nm/A280nm>1.7者作甲醛变性琼脂

16、糖凝胶电泳，继取总RNA各1.5g，按上述条件作RT，先取3l cDNA用P7和P8扩增，测定每份样品的-actin mRNA6，继作IFN-和IL-4 mRNA定量测定，即在含P1和P2(或P4和P5)的PCR反应液中各加入3l cDNA和已知浓度的相应竞争模板，按上述温度和时间扩增IFN- cDNA或IL-4 cDNA，竞争PCR产物经3%琼脂糖电泳，在SX-100 image system上摄像、以已知浓度的竞争模板定标作密度定量，推知相应mRNA的相对含量。结果1.方法可靠性的确认：提取总的RNA经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，见18s和28s rRNA两条清晰的条带。所有样品-actin

17、mRNA的RT-PCR产物吸光度一致，说明管家基因(housekeeping gene)的表达水平一致，所提取的总RNA可用于mRNA定量测定。用所建立的方法测定一名健康人PBMC经calcium ionophore 2.0mol/L和PMA 80ng/ml诱导6?h后的总RNA中IFN- mRNA和IL-4 mRNA量，分别为3.25ng和6.10ng(该计量单位系以相当于0.5g总RNA中含IFN- mRNA或IL-4 mRNA的相应cDNA ng数表示)。实验结果提示本定量方法可靠。2.健康人PBMC体外诱生IFN-mRNA和IL-4 mRNA水平(1) PMA浓度对IFN- mRNA和

18、IL-4 mRNA水平的影响：健康人PBMC未经诱导不表达IFN- mRNA和IL-4 mRNA，经40、50、80、100、140ng/ml PMA和calcium ionophore 2.0mol/L诱导7?h后，随PMA浓度增大，IFN- mRNA和IL-4 mRNA的表达逐渐增加，当PMA浓度细胞因子的mRNA为100ng/ml或80ng/ml时，IFN- mRNA或IL-4 mRNA表达量最高，超过上述浓度时mRNA量虽分别有所下降，但仍保持较高的表达水平(1、2)。1不同浓度PMA诱导正常人PBMC 7?h时IFN- mRNA和IL-4 mRNA表达量Fig 1. Change o

19、f IFN- mRNA and IL-4 mRNA in varying concentration PMA-stimulated PBMC culture from healthy volunteer harvested at 7?hcDNA(ng) correspond to IFN- mRNA and IL-4 mRNA in 0.5l total RNA2不同浓度PMA诱导正常人PBMC在7?h时IFN- mRNA和IL-4 mRNA竞争RT-PCR产物电泳Fig 2. Electrophoresis photo of competitive RT-PCR products of IF

20、N- mRNA and IL-4 mRNA in varying concentration PMA-stimulated PBMC culture harvested at 7?hThe lower bands are RT-PCR produces of competitive templet;the upper bands are RT-PCR products of target sequence.IFN- cDNA and IL-4 cDNA competitive templet is 3ng and 10ng respectively.From lanes 1 to 5(from

21、 lane 6 to 10)PMA concentration is 0,40,80,100 and 140ng/ml respectively, IFN- mRNA is 0, 1.94, 2.56, 2.89 and 2.49ng respectively; IL-4 mRNA is 0, 4.20, 6.32, 4.68, and 4.63ng respectively.(2)诱导时间对IFN- mRNA和IL-4 mRNA水平的影响：健康人PBMC经PMA 80ng/ml和2.0mol/L calcium ionphore分别诱导0、2、4、5、6、7和9?h后IFN- mRNA和IL

22、-4 mRNA表达水平随之变化。诱导6?h IFN- mRNA表达水平最高，7?h回落至5?h的水平，9?h继续有所下降；诱导7?h IL-4 mRNA表达水平最高，9?h回落至5?h的水平(3、4)。3.健康人PBMC IFN-和IL-4 mRNA表达情况：共检11名，用本法均未检出PBMC中IFN- mRNA和IL-4 mRNA的表达，提示在健康条件下，人体内PBMC不表达该两种细胞因子mRNA,或表达水平极低(在本法可测水平以下)。380ng/ml PMA诱导正常人PBMC不同时间IFN- mRNA和IL-4 mRNA的表达量Fig 3. Change of IFN- mRNA and

23、IL-4 mRNA in PMA 80ng/ml-stimulated PBMC culture from healthy volunteer harvested at distinct time cDNA(ng) correspond to IFN- mRNA and IL-4 mRNA in 0.5g total RNA480ng/ml PMA诱导正常人PBMC不同时间IFN- mRNA和IL-4 mRNA竞争RT-PCR产物电泳Fig 4. Electrophoresis photo of competitive RT-PCR products of IFN- mRNA and IL-4

24、 mRNA in 80ng/ml PMA-stimulated PBMC culture harvested at distinct timeThe lower bands are RT-PCR products of competitive templet; the upper bands are RT-PCR products of target sequence.IFN- cDNA and IL-4 cDNA competitive templet is 3ng and 7ng respectively. From lane 1 to 7 (from lane 8 to 14)incub

25、ation time is 0, 2, 4, 5, 6, 7, 9?h respectively, IFN- mRNA is 0, 1.53, 1.96, 3.10, 3.25, 3.21 and 2.80ng respectively, IL-4 mRNA is 0, 1.53, 3.32, 4.58, 6.10, 6.32 and 4.54ng respectively. 4.过敏性哮喘患者PBMC IFN-和IL-4 mRNA表达水平：共检13例，3例患者的PBMC不表达IFN- mRNA，另10例表达量为0.110.56ng, 2例患者PBMC不表达IL-4 mRNA，另11例患者的表

26、达量为1.577.61ng。讨论测定细胞因子mRNA表达水平，多以-actin等管家基因mRNA作为内对照5，测定细胞因子mRNA相对表达量(半定量)。后有学者报道对细胞因子基因表达作定量分析，Rappolee等7以已知浓度的cDNA为对照模板，Wang8等用人工合成的RNA作为定量标准，但均有不完善之处。Gilliand9等用位点指令诱变或构建新质粒的方法制备特异性的DNA片段作为扩增的竞争模板，该片段与待测细胞因子cDNA的碱基序列基本相同，差别仅在于前者或因点突变而使限制性酶切位点发生改变，或带有小的内含子，这两类模板与靶序列的差异不影响扩增效率。因而使细胞因子mRNA的定量分析方法更趋

27、完善，但因模板的制备过程较复杂，一般实验室不易实现；1993年Celi4等介绍一种合成用于竞争PCR的内标准品的快速通用的方法，使内标准品的制备大为简化，我们依据该方法的原理，自行设计和制备IFN-和IL-4 cDNA内标准品用作RT-竞争PCR的竞争模板，以3所示的IFN-为例，P1和P2扩增IFN- cDNA中152572bp和靶片段，长421bp,P3长40bp,其5端20bp序列与引物2相同，加20bp与511530bp序列互补，因此由P1和P3扩增的内标准品(竞争模板)与靶片段绝大部分序列(包括5端和3端序列)相同，仅缺531552bp的片段，长399bp，比靶片段短22bp；同理P

28、4和P5扩增IL-4 cDNA靶片段长474bp，P4和P6扩增的内标准品长454bp。在同一PCR反应体系中，应用上述内标准品作为竞争模板，既可排除模板初始浓度、模板序列和引物序列差异、反应组分和反应条件对扩增效率的影响，又可竞争底物和同一对引物(P1和P2或P4和P5)同时扩增，长度相差20bp左右的两产物可用琼脂糖电泳加以区分(5)。本法的特点是，竞争模板可纯化和定量，制备过程较Gilliland的方法简便，通过测定电泳带的密度，即可对靶序列的扩增产物进行定量，从而推知所测样本中相应mRNA的含量，竞争模板与靶片段序列差异小，在作竞争PCR时可将影响因素降至低水平，从而使检测结果更能反映

29、样本的真实情况。此外，所用的竞争模板与靶序列电泳位置接近，为判断RT-PCR产物电泳条带提供了较理想的参照物，可避免对非特异性条带的误判。5IFN- cDNA内参照标准品制备原理示意Fig 5. Schematic procedure of synthesizing IFN- cDNA internal standard as competitive templet-P1P2P3由于所测的mRNA极易降解，这直接影响mRNA定量的准确性，本法在作样品的IFN- mRNA和IL-4 mRNA定量检测前，作总RNA的甲醛变性琼脂糖电泳，旨在证实所提取的细胞总RNA未降解，用RT-PCR检测-act

30、in的表达水平一致，说明在总RNA起始量一致的条件下，管家基因(huosekeeping gene)的表达水平无差异，所提取的总RNA可用于mRNA的定量测定，以上措施为细胞因子mRNA的定量提供了必要的前提，防止因RNA降解造成测得的细胞因子mRNA量的差异，保证结果的可靠性。据报道10，未经刺激的幼稚CD45RA细胞和记忆CD45RO细胞不表达IFN- mRNA和IL-4 mRNA，经预激活和记忆CD45RO细胞可表达IFN- mRNA和IL-4 mRNA，本文所检测的10/13例哮喘患者PBMC表达IFN- mRNA，11/13哮喘患者PBMC表达IL-4 mRNA，提示本组患者中的大多

31、数，由于外来因素作用引起的非特异性炎症的存在而导致T淋巴细胞在体内被激活11，提示本法可用作哮喘治疗的疗效观察指标之一。志谢：本文承呼吸内科郭沪婴、杭晶卿医师收集哮喘病例，特此鸣谢。作者单位：朱晴晖(上海纺织第一医院 上海市呼吸特色专科免疫学分子生物学实验室 200060)帅月敏(上海纺织第一医院 上海市呼吸特色专科免疫学分子生物学实验室 200060)章谷生(上海纺织第一医院 上海市呼吸特色专科免疫学分子生物学实验室 200060)张洪熹(呼吸内科)孙碧雄(呼吸内科)参考文献1，Tang MLK,Kemp AS.Spontaneous expression of IL-4 mRNA in l

32、ymphocytes from children with atopic dermatitis.Clin Exp Immunol,1994,977:491-498.2，朱晴晖，章谷生.细胞因子的多聚酶链反应检测.上海免疫学杂志，1992，12(4)：249-252.3，Dallman MJ,Montgomery RA,Larsen CP,et al.Cytokine gene expression:analysis using Northern blotting,polymerase chain reaction and in situ hybridization.Immunol Rev,1991,119:163-179.4，Celi FS,Zenilman ME,Shuldiner A.A rapid and versatile method to synthesize internal standards for competitive P