检测丙型肝炎患者NS5区抗体的临床意义探讨

1、检测丙型肝炎患者NS5区抗体的临床意义探讨【摘要】目的检测慢性丙型肝炎患者和14例HCV原发感染后NS5抗体长达一年半的动态变化，探讨NS5抗体的临床意义。 方法应用重组NS5抗原，建立EIA方法进行检测。 结果慢性丙型肝炎患者抗-NS5抗体阳性率为60.48%，HCV感染后一月抗-NS5抗体阳性率为16.35%，三月为75%。 结论抗-NS5抗体无早期诊断价值。抗-NS5抗体持续阳性者，血清ALT多明显升高，抗-NS5抗体与肝脏疾病活动性相关。丙型肝炎患者中存在抗-C、抗-NS3、抗-NS4抗体阴性，而抗-NS5抗体单独阳性，表明检测抗-NS5抗体具有独特的诊断价值。【主题词】肝炎，丙型肝炎

2、抗体免疫酶技术 Detection of antibody to HCV NS5 and its clinical significanceLi Qingsheng*, Guo Jianping, Tao Qimin,et al.*Institute of Hepatology,Beijing Medical University, Beijing 100044【Abstract】ObjectiveTo detect the antibodies to HCV NS5 as well as HCV C,NS3 and NS4 in 115 cases of patients with chro

3、nic hepatitis C and 115 serial blood samples of 14 cases of post-transfusion hepatitis C. MethodsThe recombinant HCV NS5 antigen was used to establish EIA to capture the anti-HCV NS5 antibody. ResultsWe discovered that there were a few chronic hepatitis C patients (HCV RNA positive) and acute hepati

4、tis C patients who were anti-C, NS3 and NS4 Ab negative,while only anti-NS5 Ab was positive.The dynamic changes of anti-NS5 Ab were correlated with the serum ALT in most patients,indicating that anti-NS5 Ab may reflect liver damage and disease activity to some extent. ConclusionsThe results show tha

5、t detection of antibody to HCV NS5 has a unique value in HCV diagnosis.【Subject words】 Hepatitis CHepatitis antibodiesImmunoassy,enzyme丙型肝炎病毒(HCV)感染人体后果严重，急性丙型肝炎约40%60%转为慢性，慢性丙型肝炎20%30%将进展为肝硬化，此外，HCV感染还和肝癌发生有关1。所以，研制敏感特异的HCV诊断试剂具有重要意义。虽然目前诊断HCV感染的第二代抗-HCV试剂有较高的敏感性与特异性，但仍有为数不少的假阴性和假阳性2,3。最近国外推出了第三代抗-

6、HCV诊断试剂,它是在第二代的基础上增加NS5抗原而成，其敏感性与特异性较第二代试剂又有所提高4。为了研制我国第三代抗-HCV诊断试剂,探讨检测NS5区抗体的意义，我们在大肠杆菌中高效表达了NS5蛋白7。用此重组抗原检测丙型肝炎患者的NS5区抗体，发现NS5抗原具有优势抗原表位，在HCV感染者NS5区抗体单独阳性。现报道如下:材料与方法1.血清标本：115例慢性丙型肝炎患者血清为北京医科大学肝病研究所血清库保存的血清，病程超过半年，ALT升高，HCV RNA阳性(RT-PCR，5非编码区)。正常人血清95份为北京医科大学肝病研究所保存，无输血史及肝病史，ALT正常，抗-HCV阴性(第二代EIA

7、)。14例急性丙型肝炎患者共129份系列血清，包括受血前14份，HCV感染后115份(受血后255天、555天、90天、120天、150天、270天、360天和540天采集的标本)，由中国药品生物制品检定所汪兴太提供。2.包被抗原：检测慢性丙型肝炎患者所用核心区C和NS3区重组抗原由郭建平副研究员提供。NS4区重组抗原由军事医学科学院马贤凯教授惠赠，NS5区重组抗原由北京医科大学肝病研究所表达。检测急性丙型肝炎系列血清所用抗原，C区为C11，NS3区为C7(日本东燃公司)，NS4区抗原(加拿大Yes公司)，NS5区重组抗原由北京医科大学肝病研究所表达。3.主要试剂及材料：Hae为华美生物工程公

8、司产品，辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG为Boehringer Mannheim产品，酶标板为丹麦Nunc公司产品，HCV RT-PCR试剂盒由北京医科大学肝病研究所生产。4.酶免疫试验(EIA)：按常规方法进行。具体方法参照北京医科大学肝病研究所生产的抗-HCV试剂盒说明书。正常人血清经Western blot证实抗-NS5抗体阴性，然后用酶免疫试验检测这些血清抗-NS5抗体的A值5。正常人血清抗-HCV不同区抗体A均值+2s，作为慢性丙型肝炎患者抗 -HCV不同区抗体阳性的临界值(cut off)。急性丙型肝炎患者系列血清抗体检测方法和检测结果判断参考文献6。5.RT-PCR检测HCV RN

9、A及HCV酶切分型：应用RT-PCR检测HCV RNA，然后用Hae酶切HCV PCR产物(5非编码区)对HCV进行分型，见文献7。结果与讨论应用HCV C、NS3、NS4和NS5重组抗原，建立EIA，检测HCV RNA阳性(5端非编码区，RT-PCR)的115例慢性丙型肝炎患者，发现慢性丙型肝炎患者中抗-C，抗-NS3阳性率较高，分别为73.91%和74.78%，抗-NS4和抗-NS5低于前者，分别为69.56%和63.48%，与文献报道8结果一致。其中发现一例血清抗-C、抗-NS3、抗-NS4均阴性，而抗-NS5单独阳性的慢性丙型肝炎患者，占慢性丙型肝炎患者的0.87%。14例HCV感染后

10、115例系列血清，抗-C、抗-NS3、抗-NS4和NS5检出率分别为83.48%(96/115),81.74%(94/115),65.22%(75/115)和62.61%(72/115)，也表明抗-C、抗-NS3阳性率较高。抗-C、抗-NS3、抗-NS4和抗NS5在感染一月内，阳性率分别为84.62%(11/13),84.62%(11/13),30.77%(4/13)和15.38%(2/13)。抗-C，抗-NS3阳性率明显高于抗-NS4和抗-NS5的阳性率(P0.01)；感染后三月的阳性率分别为91.67%(11/12),83.33%(10/12),66.67%(8/12)和75%(9/12)

11、。抗-C阳性率明显高于抗-NS5(P0.01)。表明抗-C、抗-NS3出现早，有早期诊断价值，而抗-NS5出现晚，无早期诊断价值。汪兴太等6应用NS5区合成肽检测抗-NS5抗体，发现抗-NS5抗体出现晚，与本文结果一致。Barrera等9报道第三代EIA与第二代EIA相比，可提早诊断，抗-NS5有早期诊断价值，与本文结果相悖，这可能与包被的NS5抗原以及检测的病例不同有关。此外，我们在HCV感染后的115份系列血清中，发现3份血清抗-C、抗-NS3和抗-NS4抗体均阴性，而抗-NS5抗体单独阳性，占2.6%，说明检测抗-NS5有重要诊断价值。测定14例丙型肝炎系列血清抗-NS5，发现抗-NS5

12、的动态变化呈4种类型，与用合成肽检测抗-NS5的结果一致6。4种类型中抗-NS5持续阳性最常见，占42.9%(6/14),持续阴性占14.3%(2/14)，间断性阳性和一过性阳性各占21.4%(3/14)，见14。抗-NS5持续阴性者，血清ALT轻度升高或正常，而抗-NS5持续阳性者，血清ALT多明显升高(5/6)，表明抗-NS5可能与肝脏疾病活动性有关，但需今后进一步扩大病例研究。1HCV感染后血清抗-NS5和ALT的动态变化抗体持续阳性型Fig 1. Dynamics of anti-NS5 and serum ALT after HCV infection2HCV感染后血清抗-NS5和A

13、LT的动态变化抗体持续阴性型Fig 2. Dynamics of anti-NS5 and serum ALT after HCV infection3HCV感染后血清抗-NS5和ALT的动态变化抗体间断阳性型Fig 3. Dynamics of anti-NS5 and serum ALT after HCV infection4HCV感染后血清抗-NS5和ALT的动态变化抗体一过性阳性型Fig 4. Dynamics of anti-NS5 and serum ALT after HCV infection为了探讨NS5重组蛋白用于诊断HCV/1b和HCV/2a的价值有无差别，我们用Hae

14、酶切HCV RNA PCR产物对HCV分型。HCV/型10例，抗-NS5 60%阳性，HCV/型30例，抗-NS5 50%阳性，经统计学处理，抗-NS5检出率无显著性差异(P0.05)。由于我国HVC、型罕见，故可认为抗-NS5在HCV/1b和HCV/2a中检出率相近。这与重组NS5分子较大，含HCV型交叉抗原表位有关。志谢：感谢常绵红同志在本文成稿中给予的帮助。 本研究属我国八五攻关课题的一部分作者单位:100044 北京医科大学肝病研究所李庆生（现在美国明尼苏达大学医学院微生物系作博士后研究)，郭建平， 陶其敏；中国药品生物制品检定所(汪兴太, 李河民)参考文献1Schmilovitz-w

15、eiss H,Levy M,Thompson N,et al.Viral markers in the treatment of hepatitis B and C.Gut,1993,34(Suppl)S26-33.2Nakatsuji Y,Matsumoto A,Tanaka E,et al.Detection of chronic hepatitis C virus infection by four diagnostic system:first-generation and second-generation enzyme-linked immunosorbent assay,seco

16、nd-generation recombinant immunoblot assay and nested polymerase chain reaction analysis.Hepatol, 1992,16300-305.3Callahan JD,Constantine NT,Kataaha P,et al.Second generation hepatitis C virus assays.performance when testion African sera.J Med Virol, 1993,4135-38.4Buffet C,Charnaux N,Laurent-puig P,

17、et al.Enhanced detection of antibodies to hepatitis C virus by use of a third generation recombinant immunoblot assay.J Med Virol,1994,43259-261.5李庆生，郭建平，陶其敏.丙型肝炎病毒非结构基因NS5在大肠杆菌中的高效表达.中华实验和临床病毒学杂志，1996，10254-257.6汪兴太，李河民，王佑春，等.HCV感染后NS5区抗体的动态观察与检测意义.中华微生物学和免疫学杂志，1994，1473-75.7杜绍财，陶其敏，朱凌，等.丙型肝炎病毒基因5-端非编码区酶切分型.中华医学杂志，1993，737.8Lok ASF,Chien D,Choo QL,et al.Antibody response to core,envelope and noustructural hepatitis C virus antigens:Comparison of immunocompetent and immunosuppressed patients.Hep