水稻颖壳异常发育突变体Oseg1和Oseg2的基因图位克隆及基因功能分析

1、单位代号：雌擘号邶，钾上海大学硕士学位论文【蓄水稻颖壳异常发育突变体伪锚？和伪嘲的基因图位克隆及基因功能分析作者王红搀学科专业食品科学导师壅塞基煎丝韭大兵教授先成日期垫笾生！旦一懈碰如删臂上海大学硕士学位论文水稻颖壳异常发育突变体和的基因图位克隆及基因功能分析摘要利用水稻小花各轮器官发育异常的突变体来研究单子叶植物花器官发育的分子调控机制是目前植物分子遗传学的研究热点。本研究将粳稻品种进行射线诱变，从代突变体库中筛到两个颖壳发育异常的突变体，分别命名为（）和（）。在营养生长时期，这两个突变体与野生型相比，没有明显发育异常。进入生殖生长后，花的退化颖壳（）比野生型的退化颖壳明显增长；护颖（）和野

2、生型相比也异常增长；雄蕊数目减少。突变体的护颖也异常增长，一次枝梗形态弯曲，数量增多。利用电子显微镜对和的表型特征进行了细致的分析，表明和的突变影响水稻小穗顶端分生组织正常发育，造成小穗原基发育异常。分别对这两个突变体进行的遗传学分析结果表明这两个性状各受一对隐性基因控制。为了对和进行基因定位，分别将和纯合体与籼稻品种广陆矮号杂交，建立代群体，筛选代中的突变株，利用已公布的水稻系列标记及自行设计标记，应用图位克隆技术，对和位点进行遗传定位。我们将进行了初定位和精细定位，最终将定位在号染色体上标记与之间，遗传距离分别为和，为进一步克隆基因和研究水稻小穗器官发育的调控机理奠定了基础。另外，我们将精

3、细定位在号染色体上标记和标记之间，遗传距离，物理距离的区段范围内。对其中两个可能与花发育相关的基因进行测序，测序结果显示其中一个转录因子基因发生突变，命名此基因为。随后，提取野生型和突变乖奉，扩增全长后测序，证明突变体中伪匹回基因内含子剪切异常，造成移码突变。在此基础上，我们又利用干扰的方法，证明了水稻野生型的上海大学硕士学位论文基因沉默后可以产生突变体的表型，证明确实由于基因的突变产生的表型。将基因在野生型水稻中过量表达后，我们观察到伪段珏过量表达的转基因植株产生了新表型：一次枝梗数目减少，小穗夕稃顶端长出刺状器官。为研究的表达特性，我们提取了野生型水稻植株的根、茎、叶、穗、幼苗的，以瞒因作

4、参照，利用分析了在水稻生长过程中的表达情况。结果表明伽瓜刀可以在水稻根、茎、叶、穗、幼苗中表达。我们还构建了仉曰基因的原核表达载体，高效表达了蛋白，并免疫法制备了抗体。这些工作为进一步研究在水稻小穗形态建成过程中发挥的功能奠定了良好的基础。关键词：水稻（删缸口）；护颖；退化颖壳：基因定位；功能分析上海大学硕士学位论文，（）（聊），？，）（矗），前托恤，上海大学硕士学位论文：，：（）；上海大学硕十学位论文原创性声明本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己发表或撰写过的研究成果。参与同一工作的其他同志对本研究所做的任何贡献均已

5、在论文中作了明确的说明并表示了谢意。签名：至盘拉日本论文使用授权说明瓤：瑚鑫本人完全了解上海大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留论文及送交论文复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容。（保密的论文在解密后应遵守此规定）签名：至匆二移导师签名：搬日期：逊！：髟上海大学硕士学位论文第一章综述：植物花器官发育的研究进展双子叶模式植物拟南芥和单子叶模式植物水稻的花器官结构双子叶模式植物拟南芥，花辐射对称，第一轮是片萼片（），第二轮为片花瓣（），第三轮为枚雄蕊（），第四轮为心皮（）所构成的复雌蕊。、单子叶植物早在亿年前就和双子叶植物开始分开进化【”，发展到今天，花器官

6、形态已经发生了很大差异。一般认为水稻颖花（）包括片外稃（）和片内稃（），对浆片（），个雄蕊（）和个心皮（）（图，）。稃片下有一对护颖（，图，），与颖花共同构成一朵完整的小穗（）。小穗下方还有两片退化颖壳（，图，）。护颖和退化颖壳相当于双子叶植物的苞叶（）【】，其研究由于缺乏相应的突变体而受到限制。 图拟南芥花和水稻颖花的形态比较，退化颖壳；，护颖；，稃；聘内稃；，浆片；，雄蕊；，心皮；，柱头双子叶模式植物花器官发育模型拟南芥是研究双子叶植物花器官发育分子调控机理的模式植物，花由花萼、上海大学硕士学位论文花瓣、雄蕊和雌蕊轮花器官组成。通过对拟南芥突变体的研究，人们发现拟南芥中有一系列能控制花器官

7、相互转化的基因。和一这两个基因只要有一个缺失，花萼和花瓣就不能正常发育，花萼位置处发育出变形的雌蕊，花瓣位置处发育出雄蕊（图，），部分发育出了新的小花和中之一发生突变都会导致花瓣转变为花萼，雄蕊变成心皮（图，）。突变中，雄蕊和雌蕊无法发育，雄蕊位置处发育出花瓣，雌蕊位置处发育出花萼（图，）。在类基因和类基因双突变体中，类基因在各轮花器官中都具有活性，使四轮器官均变为萼片（图，）。在类基因和类基因双突变体中，类基因在各轮花器官中都具有活性，产生两轮花瓣和两轮雄蕊（图，）。在类基因、类基因和类基因三突变体中，花的各轮器官都转变成了叶状结构（图，）。通过对这些基因的研究，人们提出了关于花器官发育决定

8、的模型理论（图，），来揭示双子叶植物花器官发育的遗传控制机理【”。即在拟南芥中，花萼形态由类基因调控，花瓣形态由类和类基因共同调控，雄蕊形态由类和类基因共同调控，雌蕊形态由类基因调控。其中，类基因和类基因的活性相互抑制，类基因抑制类基因在第一轮花器官和第二轮花器官中的表达，类基因抑制类基因在第三轮花器官和第四轮花器官中的表达【】。三类基因的活性与它们在花中的位置无关。上海大学硕士学位论文 圈根据对拉南芥同源异型突变体的研究提出了模型：（）；：（）；：（国；：（）；：（唱）；：；：；：；：金鱼草也是研究双子叶植物花发育分子控制机理的模式植物，（），（）和（）分别是拟南芥中，”，和的同源基因，模型

9、对双子叶植物花发育的调控具有保守性。年人们从矮牵牛（）中克隆到了专地在胚珠原基、珠被和珠柄中表达的和用驴，发现了调控胚珠发育的类基因【，。过量表达，转基因植株的第一轮花器官和第二轮花器官上形成了异位胚珠【】。抑制和表达，在野生型植株形成胚珠的地方发育出心皮状或形似叶状的结构，命名为功能基因。之后，人们在拟南芥中克隆到了与上海大学硕士学位论文和只炉行使相同功能的基因，证明了类基因在双子叶植物中的保守性。此后，这样经典模型被扩展为模型。一如果说类基因对花发育是充分条件的话，那么在任何器官中将类基因表达，都应该能够产生花的表型。事实上，人们将类基因在叶中异位表达，无法产生花的器官【”】。因此，类基因

10、对花发育只是必要条件，不是充分条件。所以还存在着其他未发现的花诱导必需因子。后来，在年人们通过寻找能够与模型中的蛋白相互作用的蛋白的方法，发现了参与花瓣、雄蕊和雌蕊轮器官发育的类基因【，类基因由艇（也）、（也）、（也）和（也叫上）组成，彼此之间存在功能冗余。类基因与、和类基因共同作用，参与花器官的发育调控。至此，四因子模型应运而生（图）。该模型假设种花同源异形基因的不同组合决定不同花器官的特征。蛋白复合物一一？一？决定萼片形成，卜决定花瓣形成，一决定雄蕊形成，决定心皮形成（图），这些蛋白质复合物通过粘着在特异目标基因的启动子上激活或抑制不同的器官特征基因发挥功能。不同蛋白质复合物和序列之间亲合

11、力的不同和不同基因启动子区域的不同决定了蛋白质复合物和目标基因的相互选择。上海大学硕士学位论文 图控制双子叶植物花器官发育的模型【引自】上海大学硕士学位论文值得注意的是，除了一朋，控制双子叶植物花器官发育的模型中的这些基因都有一个命名为域的保守的结合域，属于基因家族的成员。调控单子叶植物花器官发育的分子机理的研究进展通过研究水稻中一些与双子叶植物模型基因同源的盒基因，人们已经克隆了一些与水稻花器官发育相关的基因，初步分析了控制水稻花器官发育的分予机理。类基因：水稻中与相似性最高的基因是（也叫删傩，）【“，特异在幼嫩花序及小穗分生组织中表达。小穗器官分化后，在内外稃和浆片中表达，在护颖中也有微弱

12、表达。（也叫、）和（也叫）】与序列相似性也很高【。在水稻小穗所有部位都表达，小穗成熟后，在浆片和颖片中检测不到其表达。起初在颖片、内外稃中表达，小穗成熟后，只在雄蕊和心皮中检测到表达【。尽管和与序列相似性很高，表达模式却大不相同。姒列钳表达模式与五，相似，还需要功能分析来确定是否一朋在水稻中的同源基因。早期在花原基各处表达，后期只在内外稃和胚珠中表达，突变体内外稃和浆片转化成叶状，部分小穗产生了新的小花【”，说明有花分生组织决定作用。这个表型与相似，但是是否是类基因仍然需要鉴定。类基因：根据序列相似性，和是，是【。研究证实，（突变体命名为）和可以调控水稻花的浆片和雄蕊的特征，类基因在双子叶植物

13、和单子叶植物进化过程中的保守性已经被证明讲，圈，浆片被认为与双子叶植物中花瓣同源。类基因：研究证明，姒纠野（也叫删）在只在雄蕊和雌蕊中表达，调控雄蕊和心皮的特征，属于类基因瞄。类基因在双子叶植物和单子叶植物中是保守的。在胡突变体中，心皮被同源异型转化为雄蕊。在花发育中，基因的表达开始于心皮原基起始的区域，并且在心皮原基中持续表达。因此，上海大学硕士学位论文基因仅特化一轮花器管的特性。从这个方面讲，模型在水稻中被修改了。近期研究证明，单子叶植物和双子叶植物分开进化后，类基因在单子叶植物中发生了复制，功能分离，和在水稻中共同行使了类基因功能刚。类基匿乱与和具有序列相似度叨，表达方式相似，在胚珠和心

14、皮内层表达。与和一样，能够结合特异基因，来行使基因功能。说明类基因行使基因功能的方式在双子叶植物和单子叶植物中是保守的。类基因：系统进化分析显示，（也叫）、（也叫）、仇朋脚、与基因同组，亲缘关系较近田】，最近的是和，早期在浆片和雄蕊原基分生组织中表达，后期在浆片、雄蕊和雌蕊原基中表达，是类基因在水稻中的候选基因。由于具有分生组织决定性，也是类基因在水稻中的候选基因。”。基因家族除了丘船，几乎所有基因都是高度保守的，含有保守结构域，属于基因。来自，及蛋白的首字母。是酵母细胞类型的调节因子，是酵母精氨酸代谢基因的调节因子，与匀是花器官类别基因产物，则是人血清应答因子（）。和两个结合蛋白均识别靶序列

15、（】。该序列编码一个与特定序列结合的转录因子功能的结构域。对于维管植物而言，基因编码的转录因子具有保守结构特性，也称之为切结构域【，即包括，（），（）和（）域。（）结构域是由个氨基酸残基组成的高度保守的区域，是与结合的主要决定因素。它形成二聚体调节与的结合。该区域可部分的折叠，形成由螺旋所形成的反向平行的螺旋卷曲螺旋，平躺于的小沟中。它识别（特征序列，该序列称为（），它存在于许多基因的启动子区域内，因此蛋白上海大学硕士学位论文可能通过对（的调控来调节基因的转录。（）结构域是一段约个氨基酸残基的片段，与角蛋白（）部分同源，至今在动物和真菌中还未被发现。二级结构分析表明结构域含有个螺旋，和，与疏水

16、残基有保守的整齐间距，能在蛋白二聚体中形成两亲和性螺旋结构，调解蛋白质之间的相互作用。（）在结构域和区域之间存在一段个氨基酸的区域，含有较多亲水残基的非保守区域，帮助转录因子蛋白二聚体与结合形成复合体。（）结构域下游的非保守的端主要由疏水氨基酸组成，约个氨基酸长度的富含疏水残基的非保守区域，可能作为基因的转录激活区域，与多聚体高级结构有关【】。编码具有这些区域的基因被称为型基因。此外，在少数区上游还有一个延伸的区，具有这种结构的基因被称为型。如人的在区前就有一段较长的延伸区。通过对人的。射线晶体衍射研究发现，的两个单体以二聚体形式结合在一起，核心区由结构域个氨基酸和延伸的约个氨基酸组成，二聚体

17、分成三个结构单元叠加在一起。第一个结构单元是结合区，由分别来自两个单体的旺螺旋形成的一个反平行的螺旋卷曲螺旋。这两个螺旋平行于其识别的的双螺旋的小沟，并与的磷酸骨架接触，分子包裹在螺旋卷曲螺旋的周围，两个螺旋的链端即两个单体的段插入的双螺旋的小沟内和分子相结合。第二个结构单元式四段反平行的折叠，由结构域端和延伸的一段氨基酸组成（对应于植物蛋白区）。第三个结构单元即顶部，位于折叠上方，是由一个不规则的螺旋卷曲螺旋紧接着一个短的螺旋组成。由于，和在此部分结构相似，又称之为结构。由于结构与在氨基酸组成上的高度相似性，对作用机理的分析也同样适用分析植物中的蛋白。等发现，植物结构组成在功能上的分配也是和

18、相似的：端进行结合，端主要起到形成二聚体的作用，区寸蛋白形成二聚体是必不可少的。水稻花序原基分化过程植物发育的模式与动物相比具有显著的差异。在动物的个体发育过程中，其形态的建成发生在胚胎发生阶段（），与器官形成相关的细胞分上海大学硕士学位论文裂和分化活动集中出现在这一阶段。在胚后的发育阶段，虽然仍然有细胞分裂和分化的发生，但这些细胞的分裂和分化的作用主要是维持器官的正常功能。而植物的形态建成主要通过分生组织（）的分裂和分化活动，在一个相当长的时期内完成。分生组织是一群未分化的、不断分裂的细胞。在植物的胚胎发生阶段，植株就形成了根端分生组织（）和茎端分生组织（），在胚胎发生后的发育过程中，顶端分

19、生组织不断的分化形成新的侧生器官】。一方面，分生组织能够根据外界环境的刺激及内部遗传因子的控制，不断的分化出根、茎、叶、枝、花等器官，以保证植物能够完成整个生命周期；另一方面，分生组织能够不断的分裂，以填补由于器官形成过程中所消耗的细胞，以保持自身的完整性【】。营养生长阶段，茎端分生组织不断分化产生叶原基（图，）。进入生殖生长后，茎端分生组织分化产生初级枝梗分生组织（图，）。之后，初级枝梗分生组织分化产生小穗枝梗分生组织（也级枝梗分生组织）、终端穗分生组织和侧生穗分生组织（图，），穗分生组织分化产生小穗原基。小穗原基依次分化产生外退化颖原基、内退化颖原基、外护颖原基、内护颖原基、外稃原基和内稃

20、原基（图，）。原基逐渐发育成器官，内外稃闭拢，包住内部花器官，形成完整小穗（图，）。一个发育成熟的水稻花序示意图见图，。上海大学硕士学位论文赢：虢融：翼蜘图水稻茎端分生组织（）发育示意图【引自叻叶原基；，初级枝梗分生组织；，既终端穗分生组织；，侧生穗分生组织；，穗枝梗分生组织；，化颖；，内退化颖；护颖；，啪内护颖；，稃；，内稃；，主轴；，初级枝梗；，二级枝梗；，终端穗；，侧生穗；却，退化点趴上海大学硕士学位论文第二章控制水稻护颖发育的基因的图位克隆及功能分析材料和仪器水稻材料的种植及突变体来源用”射线诱变粳稻种子，处理剂量为。在代分离群体中获得一株颖壳异常发育的突变体，将该突变体与野生型回交代

21、，获得隐性单基因控制的的突变体。所有植物材料种植于上海市农业科学院实验基地。突变体的遗传分析和定位群体的构建将突变体与籼稻品种广陆矮号杂交，获得代。代自交获得代，大田种植，出现表型后，选择其中的突变植株作为定位群体。本研究中筛选到定位群体抹。水稻植株的表型观察大田种植植株。待植株抽穗后，对野生型和突变体进行观察拍照。实验试剂及配方本实验所用的引物由上海博亚（英骏）生物工程技术服务有限公司合成。、和等购自公司。水稻培养基购自。其余试剂为国产分析纯产品。（）（）（）（）氯仿：异戊醇氯仿：异戊醇的体积比为：（）聚丙烯酰胺母液丙烯酰胺，一亚甲双丙烯酰胺尿素×加水至（）硝酸银染色液在毫升水中加

22、入硝酸银。（）显影液在水中加入：四硼酸钠甲醛（）固定液无水乙醇冰醋酸甲醛水（）基础培养基：母液：大量元素（）母液：）（钙盐（）。母液：钾盐（）。母液：微量元素（）。、。母液：×维生素（）甘氨酸盐酸硫胺素盐酸吡哆素烟酸肌醇母液：铁盐（）配制培养基时分别加入母液、各，母液、各和母液，另加入蔗糖，调节值至，高压灭菌（固体培养基加的琼脂）。（）：在基础培养基中添加以下物质：干酪素蔗糖，调节值至，高压灭菌。上海丈学硕士学位论文（）：除了，的浓度为外，其余同。（）血液体培养基：在基本培养基中添加：干酪素扎蔗糖，（乙酰丁香酮）洲调节值至，高压灭菌。（）：中加入“乙酰丁香酮。（）：中加入的头孢氨苄，

23、）的潮霉素。（）：中加入的头孢氨苄，的潮霉素。（）：在含有的水（灭菌）中添溶液溶液溶液头孢氨苄舡潮霉素（）：在基础培养基中添加：干酪素玉米素（）上海大学硕士学位论文激动素头孢氨苄潮霉素蔗糖山梨醇调节值至，高压灭菌。（）：在基础培养基中添加：干酪素潮霉素头孢氨苄蔗糖几调节值至，高压灭菌。（）检测试剂封闭缓冲液：，：调节。现配现用：取络，加在皿水中，取止用稀释至。每孔加皿。（）配制甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液：成分配制不同体积和浓度凝胶所需各成分的体軎胶水丙烯酰胺混合液几上海大学硕士学位论文，过硫酸铵胶水丙烯酰胺混合液（过硫酸铵功，配制甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶所用溶液：成分配制不同

24、体积和浓度凝胶所需各成分的体积，水丙烯酰胺混合液过硫酸铵（）×一甘氨酸缓冲液（）碱甘氨酸（电泳级）（）（）×凝胶加样缓冲液（电泳级）溴酚蓝甘油（）考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝甲醇冰醋酸上海大学硕士学位论文（）考马斯亮蓝脱色液甲醇冰醋酸实验仪器型扩增仪（）型电泳槽（北京六一仪器厂）型电泳仪（北京六一仪器厂）型，高速冷冻离心机（德国公司）移液器（）冰箱（）。冰箱（）冰箱（微波炉）基因导入仪（宁波新芝科器研究所）洁净工作台（上海博迅有限公司医疗设备厂）型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）恒温振荡器（江苏太仓市试验设备厂）解剖镜（型脱色摇床（上海琪特分析仪器有限公司）电子天平

25、（￥型离心机（型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）压力蒸汽灭菌锅（上海博迅有限公司医疗设备厂）制冰机（）自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）上海大学硕士学位论文实验方法法提取水稻总根据公布的提取水稻总的方法【“，称左右的水稻叶片放入小研钵，加入适量的液氦，立刻研磨至粉末，放入的管中，可暂时保存在。中。加入止的的溶液于前离心管中，小心混匀后放入水浴摇床，摇床频率为。后取出离心管，加入等体积氯仿：异丙醇，猛烈摇匀，离心，。取上清（注意不要带入氯仿）于备好的新管中，加入倍体积的预冷的异丙醇（或倍的无水乙醇），先缓慢混匀，再猛烈混匀几下，使成团，放入以上。将析出的离心。弃上清，将沉淀用的乙醇洗

26、涤一次，离心后干燥。将沉淀溶于此或超纯水中。分子标记分析标记根据已发表的序列合成：）。标记的设计是根据已发表的粳稻日本晴和籼稻【刀两品系的核苷酸序列，将粳稻与籼稻的克隆序列进行比较，在差异序列两侧利用软件设计引物，然后验证在个亲本粳稻和籼稻广陆矮号之间的多态性。程序参考蜘等人的方法【司做了部分调整。此的反应体系中包括：州的引物，州，×（，胶），的模板，的酶。反应程序为：预变性，循环（，）次，最后延伸。聚丙烯酰胺变性凝胶电泳和银染采用的变性电泳和银染的方法染色，。扩增产物用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳。包括以下三个基本操作步上海大学硕士学位论文骤。制胶：聚丙烯酰胺变性胶的配制方法是：取丙烯酰

27、胺母液，加入的过硫酸胺，此，搅匀，立即注胶；注满后，放平玻璃板，使其与桌面成左右的角度，插入梳子；静放个小时。点样：待胶完全凝固后，小心拔出梳子，用蒸馏水反复冲洗点样孔，清除多余没有凝固的物质；将玻璃板固定在垂直电泳槽上，加入适量的×缓冲液；取扩增产物，每管加入此含溴酚蓝和二甲苯氰两种指示剂的载样缓冲液，用微量进样器取止，样品注入点样孔。电泳：调电压至，电泳时间约为。电泳完毕后，将玻璃板从电泳槽上拆下，取出凝胶，在蒸馏水中漂洗两次，每次约；转入溶液中，在摇床上轻摇，染色：然后将凝胶转移到蒸馏水中漂洗两次；最后转入显影液中显色，着色后转入水中保存。凝胶成像，数码相机拍照记录结果。群体分

28、离分析方法根据公布的群体分离方法（，）】，从分离群体中随机取个样品取等量叶片混合提取构建一个突变池（或者分别提取然后取等量混合），以突变池为模板，用覆盖基因组的分子标记进行扩增反应，同时扩增两亲本和杂交代模板作为对照。在突变池中与突变基因连锁的座位的遗传背景偏向突变体来源的亲本，通过凝胶分析可以看出，突变体来源的亲本条带和对照相同，而用于杂交的另一亲本条带没有或弱于对照。连锁分析根据公布的连锁分析方法，用筛选出来的多态性分子标记对定位群体中的突变株进行基因型分析，利用构建目标基因区域的分子标记的连锁图谱。上海大学硕士学位论文扫描电镜观察扫描电镜的观察参考等人的方法作了部分调整【】。（）材料固定

29、：固定液固定样品，小时以上。（）材料脱水：，乙醇梯度脱水，每级，脱水剂体积高于材料的倍。（）临界点干燥。（）上铜台：将样品用导电胶固定于铜台上，并将样品调整至适于观察的位置。（）样品喷金。（）扫描电镜观察。水稻的幼胚转化及组织培养水稻幼胚转化及组织培养参照【和等人的方法作了部分调整。（）幼胚材料的预处理采集受粉后一天未成熟的种子，在这个时期的胚乳相对固化，但仍成乳状。将去壳种子在乙醇中浸泡后，在漂白剂（含）中灭菌。无菌水洗次。在无菌条件下有手术刀和镊子解剖幼胚。将幼胚直接转入培养基平板中。暗培养天。当黄色愈伤组织在胚轴出现时（通常需要四天，在这期间，根通常有长），切除根部和胚乳，将胚轴转移至一个新鲜的培养基平板，钝形面向下。暗培养天。（）挑取农杆菌单菌落，在加卡那霉素的培养基基中震荡培养约（，），至为。（）离心，在液体培养基中重悬沉淀至浓度为。（）将个带有黄色愈伤的胚浸泡在细菌悬液中，间或震荡。（）从悬液中收集胚，在两张无菌滤纸间吸干。（）在培养基平板表面放上无菌滤纸，把胚放在滤纸表面，暗培养天。（）把胚的根部去掉，把胚放入培养基平板上，切割面向下，暗培养天。（）再转入新鲜的的培养基平板上暗培养天。在这个时间可以看见新的愈伤长出。（）把抗性愈伤（将抗性愈伤从胚上切下）放在预分化培养基（）平板上海大学硕士学位论文上，暗培养天。（）把愈伤放在生芽培养基培养基平板上，（小时光照，