抗11β羟类固醇脱氢酶1的单克隆抗体的制备与鉴定

1、抗11羟类固醇脱氢酶1的单克隆抗体的制备与鉴定 11-01-31 14:54:00 编辑：studa20 作者：王婉, 杨金菊, 刘莉, 陈志成, 高媛, 高建恩, 安立国, 孙启鸿【摘要】 目的: 制备抗人11羟类固醇脱氢酶1（homo sapiens hydroxysteroid 11beta dehydrogenase 1, HSD11B1）的单克隆抗体（mAb）并初步鉴定其特性。方法: 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体, 用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备mAb, 并通过间接ELISA法、 Western blot、 免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定, 通过

2、免疫沉淀、 UniZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原。结果: 通过间接ELISA筛选获得1株可稳定分泌抗人HSD11B1 mAb的杂交瘤细胞系。其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG1（）, Western blot 结果显示该mAb可以特异地识别相对分子质量(Mr)为35000的蛋白; 应用mAb CBF245对人肝脏cDNA表达文库（UniZAP XR）进行筛选, 阳性噬菌斑测序结果显示5个阳性克隆插入序列均为HSD11B1。结论: mAb BAD062特异地识别抗原HSD11B1, 该mAb可用于ELISA检测、 Western blot、 免疫组化和免疫沉淀实验, 为HSD1

3、1B1的研究提供了有力的工具。 【关键词】 HSD11B1 单克隆抗体 线粒体Abstract AIM: To generate and identify monoclonal antibodies (mAb) against homo sapiens hydroxysteroid 11beta dehydrogenase 1 (HSD11B1). METHODS: Normal human liver tissues were homogenized, and mitochondria were isolated by differential centrifugation. The tot

4、al mitochondrial proteins were used to immunize BALB/c mice to generate mAb by hybridoma technique. The mAb were characterized by ELISA, Western blot and immunohistochemistry. The antibody specificity was identified by immunoprecipitation (IP), and confirmed by UniZAP expression library screening. R

5、ESULTS: One hybridoma CBF245 secreting specific mAb against HSD11B1 was established. The Ig subclass of this mAb was IgG1, and it could be used in ELISA, Western blot, immunohistochemistry. Our data showed that the antigen recognized by CBF245 mAb was localized in the hepatocyte cytoplasm, with mole

6、cular weight of Mr 35 000 in the mitochondria of human liver tissue. The CBF245 mAb was further confirmed by immunoscreening of UniZAP XR liver cDNA expression library. CONCLUSION: A hybridoma cell line stably secreting specific mAb against HSD11B1 is established and characterized. This mAb reacted

7、with HSD11B1 in ELISA, Western blot, immunohistochemistry assay, IP, and would be very useful for the HSD11B1 studies.KeywordsHSD11B1; mAb; mitochondria11羟类固醇脱氢酶1（homo sapiens hydroxysteroid 11beta dehydrogenase 1, HSD11B1）属于短链脱氢/还原酶蛋白超家族(SDR), 为相对分子质量(Mr)为34000的糖蛋白。此酶主要以糖基化的形式存在于微粒体, 其作用依赖于辅酶NADP,

8、在体内负责活性的糖皮质激素向其无活性前体的转换, 调节局部糖皮质激素浓度, 并决定糖皮质激素流向其受体1。代谢综合征糖皮质激素敏感性增加, HSD11B1调节异常, 可能是肥胖、 糖耐量低减、 高血压和心血管疾病等代谢综合征重要发病机制之一, 选择性HSD11B1抑制剂有望成为其治疗靶点。HSD11B1在体内广泛表达, 多分布于肝、 肺、 脂肪组织、 脉管系统、 卵巢及中枢神经系统。我们在成人肝脏线粒体单克隆抗体(mAb)库的建立中, 应用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠制备mAb, 其中1株为鼠抗人HSD11B1 mAb, 并对其特异性进行了鉴定, 为进一步研究HSD11B1的作用奠定了基础

9、。1 材料和方法1.1 材料 免疫和筛选用成人肝组织线粒体总蛋白, 由本室制备; 弗氏佐剂为Sigma公司产品; 羊抗鼠IgGHRP为中山公司产品; 蛋白酶抑制剂为Roche公司产品; BCA蛋白定量试剂盒为Pierce公司产品; cDNA 表达文库为美国Stratagene公司产品; PVDF膜、 ECL反应试剂盒均为Amersham公司产品; DY89型电动玻璃匀浆机构自宁波新芝生物科技股份有限公司。1.2 方法1.2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 成人肝组织匀浆700750 r/min, 10 g组织加40 mL匀浆缓冲液800 g离心10 min, 取上清, 10000 g离心

10、10 min, 沉淀即为线粒体, 用匀浆缓冲液洗2次2。用RIPA裂解液裂解线粒体样品, 离心后取上清, 获得线粒体总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度, 计算线粒体的得率, 通过测定匀浆液和分离的线粒体中的琥珀酸脱氢酶的活性计算线粒体的富集度, SDSPAGE鉴定抗原的Mr。1.2.2 鼠抗人mAb的制备 首次免疫免将线粒体总蛋白1 mg与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化, 多点皮下注射。首次免疫后4周加强免疫1次, 1周后经尾静脉取血, 分离血清, ELISA法包被线粒体总蛋白10 g/L测定效价。融合前3 d进行加强免疫, 取小鼠脾细胞与X653细胞进行细胞融合, 采用杂交瘤技术制备mA

11、b。1.2.3 抗体识别抗原的鉴定 （1）免疫沉淀: 应用CBF245 mAb从线粒体总蛋白中免疫沉淀相应的抗原, 进一步还原SDSPAGE电泳, 电转至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h, 然后加入12000稀释的mAb, 室温下孵育2 h（或4过夜）, TBST缓冲液洗膜后, 加入羊抗鼠IgGHRP抗体（15000稀释）, 室温下孵育1 h, TBST缓冲液洗膜后, ECL法显色。（2）抗原的UniZAP XR人肝脏cDNA表达文库筛选: 取大肠杆菌XL1BLUE MRF过夜培养菌接种于LB培养液中, 37震荡培养至A600为0.7左右, 3000 r/min下离心10

12、min, 用10 mmol/L的硫酸镁重悬细菌沉淀至A600为0.5, 取适当稀释的文库60 L（含约50000个噬菌体）与600 L重悬的XL1BLUE MRF混匀后37温育20 min, 铺至150 mm的NZYLB平板上, 42倒置培养至噬菌斑模糊可见, 将浸泡过IPTG的NC膜覆盖表面, 37继续培养3.5 h, 用防水墨水定位后, 剥离滤膜, 进行常规Dot blot检测。在原位板上回收阳性克隆, 用ExAssist辅助噬菌体进行体内剪切、 测序及Western blot分析。1.2.4 mAb的鉴定 （1）Western blot分析: 线粒体总蛋白经还原SDSPAGE后, 电转至

13、PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h, 然后加入12000稀释的mAb, 室温下孵育2 h（或4过夜）, TBST缓冲液洗膜后, 加入羊抗鼠IgGHRP抗体（15000稀释）, 室温下孵育1 h, TBST缓冲液洗膜后, ECL法显色。（2）免疫组化鉴定: 用丙酮固定的冰冻成人肝组织切片, PBST浸洗5 min后每个组织片滴加25 mg/L的Avidin 50 L, 室温孵育15 min, 滴加30 mL/L H2O2甲醇, 室温孵育15 min。滴加正常羊血清室温下封闭30 min, 加入1100稀释的鼠抗人HSD11B1 mAb, 4孵育过夜。PBS洗片后加入羊抗鼠IgGHRP, 37孵育30 min, PBS洗片后进行DAB显色, 苏木素复染, 返蓝后封片。2 结果2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 通过差速离心方法分离线粒体,