核因子NFκB对帕金森病MPTP模型小鼠黑质COX2表达的影响(1)

1、    核因子NFB对帕金森病MPTP模型小鼠黑质COX2表达的影响(1)    】  目的: 研究核因子（NFB）在1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)所致小鼠帕金森病(PD)模型中的影响和对环氧合酶2(COX2)的表达调控作用以及人参皂甙Rg1对其的影响，探讨导致多巴胺(DA)能神经元变性失活的可能机制. 方法: 采用MPTP制备亚急性PD小鼠模型,用免疫组织化学法和免疫蛋白印迹法观察小鼠黑质区酪氨酸羟化酶(TH),COX2，前列腺素E2（prostaglandine2，PGE2）以及NFB

2、的表达变化；并观察给予人参皂甙Rg1对上述变化的影响. 结果: 与对照组小鼠相比,模型组小鼠出现典型PD症状,在MPTP第5次注射后24 h，黑质区NFB（34.6±5.6），COX2（28.2±5.1）, PGE2(36.1±4.2)阳性细胞较对照组NFB（2.5±0.8），COX2（1.0±0.3）, PGE2(3.2±0.4)阳性细胞显著增加(P<0.01), TH阳性神经元显著丢失60%(P<0.01)；经人参皂甙Rg1处理后,模型组小鼠PD症状减轻,与模型组比较,黑质区NFB（4.9±2.1），COX2

3、 （1.9±0.7）,PGE2(4.6±0.3)阳性细胞明显减少(P<0.01)，TH阳性细胞数较对照组仅下降32%. 结论: 核因子NFB在亚急性PD模型早期对黑质COX2表达中可能起重调控作用；人参皂甙Rg1可能影响NFB及C0X2表达而对小鼠多巴胺神经元起一定保护作用. 【关键词】  帕金森病；炎症；环氧合酶2；前列腺素E2；核因子NFB；人参皂甙Rg1    0引言    帕金森病(parkinsons disease，PD)是一种常见的中枢神经系统变性疾病. 有研究1认为,炎症可能在PD发

4、病过程中起重作用, 环氧合酶2(cyclooxygenase2，COX2)及其介导的炎症反应可能参与PD发病过程2. 核因子(nuclear factorappaB, NFB)在炎症反应过程中发挥重作用，近期的研究显示NFB的激活与PD发病有关3. 但有关NFB是否参与PD模型中COX2表达调控的报道少见. 本研究采用1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶（1methyl4phenyl1, 2, 3, 6tetrahydropyridine,MPTP）制备亚急性PD模型,观察模型动物中脑黑质NFB和COX2及其产物前列腺素E2（prostaglandine2，PGE2）表达与小鼠黑质区酪氨酸羟化酶

5、(tyrosine hydroxylase，TH)阳性神经元数量关系及给予人参皂甙Rg1后对上述变化的影响,探讨NFB在PD发病过程中的分子机制，为探索PD有效防治措施提供线索.    1材料和方法    1.1材料健康雄性C57BL/6N小鼠45只，812 wk龄，体质量2530 g北京维通利华实验动物技术有限公司SCXX(京)20020003,小鼠均自由进食饮水,室温（25±2），单笼喂养，自然光照. MPTP(美国Sigma公司)；兔抗人PGE2 mAb(美国Cayman公司)；小鼠抗人TH mAb(美国Chemico

6、n公司)；人参皂甙Rg1（吉林大学基础医学院化学教研中心）；兔抗人COX2 mAb,兔抗人NFB（p50）多克隆抗体, 浓缩型免疫组织化学超敏UltraSensitiveTMSP试剂盒(福州迈新生物).    1.2方法    1.2.1动物分组和模型制备实验随机将小鼠分为3组，每组15只. 模型组(PD组)：给予MPTP 30 mg/kg,盐水溶，腹腔注射,1次/d,连续5 d. 人参皂甙Rg1干预组 (Rg1组)：除给予PD组相同的MPTP处理外,MPTP注射前3 d定时给予人参皂甙Rg1 10 mg/kg,盐水溶，腹腔注射，并在

7、MPTP注射前2 h注射人参皂甙Rg1. 溶剂组（对照组）：注射与PD组和Rg1组等体积的盐水. 上述动物均于MPTP第5次注射后24 h处死. 于每次注射药物后观察小鼠是否出现静止震颤、肌肉僵直、运动迟缓等PD行为学表现, 判断PD鼠模型是否成功.    1.2.2免疫组织化学检测小鼠麻醉后,行40 g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液常规灌注固定,迅速开颅取脑,40 g/L多聚甲醛固定48 h(4)后,石蜡包埋切片. 实验时取脑组织切片常规脱蜡至水后,用TBST(pH7.4±0.2) 洗涤；组织抗原行水浴法热修复；30 mL/L过氧化氢阻断内源过氧化物酶,正常

8、非免疫动物血清室温孵育10 min；同一组织相邻切片分别加入一抗即兔抗人COX2 mAb(1100)、兔抗人PGE2 mAb（1300）、兔抗人NFB（p50）多克隆抗体（1100）、小鼠抗人TH mAb(1400), 4过夜；TBST洗涤后,加入生物素标记第二抗体室温孵育；TBST洗涤,加入链霉素抗生物素蛋白过氧化酶室温孵育20 min,DAB显色,中性树胶封固,光镜下观察照相.    1.2.3Western Blot小鼠麻醉后取脑,分离中脑黑质部分,置入细胞裂解液中,低温匀浆,4震荡30 min后,12 000 g 4离心15 min,取上清,-80保存备用

9、. 实验时取标本蛋白定量后加入4倍体积样本缓冲液,95变性5 min. 取20 g样品在100 g/L十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE）上电泳后,电转至硝酸纤维素膜,以标准蛋白Marker为参照，依Mr大小切取条带,取相应条带分别加入COX2一抗(1400)，PGE2 一抗（1600），NFB（p50）一抗（1200）和TH一抗(11000), 4过夜,TBST冲洗后,分别与生物素标记的羊抗兔/小鼠IgG抗血清(1200)室温震荡孵育2 h,TBST洗涤后,与卵白素辣根过氧化物酶复合物室温下孵育0.5 h, DAB显色. 将特异性蛋白条带扫描后,在同一条件下应用CMIAS真彩医学图

10、像分析系统测定条带平均灰度值.    统计学处理:选定黑质所在区域,采用CMIAS真彩色医学图像免疫组化自动分析系统进行阳性细胞计数. 各组每只动物的3张脑片数值相加后取平均值,实验结果采用SPSS11.0统计软件进行统计学分析. 组间比较采用单因素方差分析和SNKq检验，两变量间关系分析采用简单线性相关分析法. P<0.05为差异具有统计学意义.              营生网-关注您的营生   

11、     【摘】 目的: 研究核因子（NFB）在1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)所致小鼠帕金森病(PD)模型中的影响和对环氧合酶2(COX2)的表达调控作用以及人参皂甙Rg1对其的影响，探讨导致多巴胺(DA)能 .         本篇论文由网友投稿，3COME文档只给大家提供一个交流平台，请大家参考，如有版权问题请联系我们尽快处理。    2结果    2.1行为学观察PD组小鼠于第1次注药

12、后10 20 min均出现不同程度的震颤、竖毛、翘尾,MPTP第5次注射后,PD组小鼠出现步态蹒跚、活动减少、动作变慢等症状；对照组未出现上述行为学变化；Rg1组与PD组相比较，上述行为学症状明显减轻.    2.2免疫组化检测    2.2.1黑质区TH阳性神经元数量变化对照组黑质致密部可见大量的TH阳性神经元,且排列整齐,呈条带状(图1A)；PD组（57.2±12.1）与对照组（169.7±24.6）相比较,TH阳性神经元的数目减少约60%(图1B),Rg1组（145.8±28.4）TH阳性神经元的缺

13、失较PD组明显为轻,仅较对照组减少约32%(图1C).    2.2.2黑质区COX2，PGE2和NFB阳性细胞数量变化PD组与对照组相比较，黑质区可见大量COX2（28.2±5.1 vs 1.0±0.3），PGE2(36.1±4.2 vs 3.2±0.4)和NFB（34.6±5.6 vs 2.5±0.8）阳性细胞（图2A，C，E）；Rg1组黑质区COX2(1.9±0.7)；PGE2(4.6±0.3)和NFB(4.9±2.1)阳性细胞较PD组有显著减少（图2B，D，F）. 图

14、像分析结果显示，PD组，Rg1组和对照组间差异均有统计学意义（P<0.01）. 同时COX2，PGE2间存在正相关关系（r=0.576，P<0.05）；COX2和NFB间也存在正相关关系(r=0.588, P<0.05).    2.3Western Blot检测在预染蛋白标准分子质量20×103，72×103，50×103和61×103处,分别可见PGE2，COX2，NFB和TH特异性蛋白条带. 灰度分析发现,PD组与对照组相比，TH的表达下降约为65，而NFB和COX2，PGE2的表达则明显升高(P&l

15、t;0.01)；Rg1组与对照组相比较，TH表达量下降约为36，NFB，COX2和PGE2的表达较模型组均显著降低(P<0.01)；对照组仅有少量NFB，COX2和PGE2的蛋白表达（图3, 表1）. 表1各组小鼠中脑黑质TH，COX2，PGE2和NFB蛋白表达水平    3讨论    PD是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,主病理改变是中脑黑质DA能神经元进行性变性缺失. 我们采用MPTP复制的小鼠模型具有PD典型行为学表现；Western Blot结果显示腹侧中脑TH蛋白的表达下降,提示此模型存在DA能神经元大量丢失,说明本

16、实验PD模型符合实验求4.    近年来有研究表明,PD中存在炎症,是PD患者黑质DA缺失重原因5. 炎症介质PGE2及其合成限速酶C0X2可作为炎症反应的重生物学指标6-7. 实验中我们检测了三者表达情况，发现PD组COX2，PGE2均大量表达，同时伴有中脑腹侧TH表达水平急剧下降，这些都提示PD组小鼠脑内存在严重的炎症反应，并可能与DA能神经元丢失有关2，说明COX2可能通过介导炎症反应,而参与DA能神经元丢失过程. 因此，研究COX2表达的调控机制，将对探讨DA神经元的保护机制起重作用. 有研究3发现，NFB作为促炎症基因表达的枢纽之一,可诱导COX2表达，

17、且NFB的激活与PD的病理机制有关. 为明确NFB是否参与COX2表达及与DA能神经元变性丢失的关系，我们观察了上述三者在中脑黑质区的表达情况，结果发现PD组NFB，COX2表达明显升高，且两者间存在正相关关系(r=0.5838, P<0.05),TH表达明显下降（P<0.01）. 我们推测，在本实验条件下MPTP可能激活NFB,继而促进COX2和PGE2的表达,从而影响DA能神经元的变化，其结果与文献报道一致8.    人参皂甙Rg1具有抗炎、抗氧化等作用. 有报道称Rg1对MPTP致黑质区DA能神经元的损伤有一定保护作用9. 为探讨人参皂甙Rg1对

18、DA能神经元的保护途径,我们对小鼠给予人参皂甙Rg1干预，发现NFB阳性细胞以及蛋白水平较PD组有明显减少，相应黑质区TH阳性细胞数量和蛋白水平较PD组降低程度减轻. 可能的原因是Rg1通过减少NFB表达来抑制COX2表达,减轻其介导的炎症反应,使黑质DA能神经元免于MPTP诱导的损伤，最终起到保护DA神经元作用10.    综上所述，核因子NFB可能是MPTP所致亚急性PD模型中脑黑质COX2表达及其介导的炎症反应的重上游事件；人参皂甙Rg1可对核因子NFB产生影响进而对黑质DA能神经元起一定的保护作用.【参考文献】  1 Hald A, Lothar

19、ius J. Oxidative stress and inflammation in Parkinsons disease: Is there a causal linkJ. Exp Neurol, 2005,193(2): 279-290.2 师亮,张宇新,张作凤,等. COX2对帕金森病小鼠黑质内多巴胺能神经元的毒性作用J. 第四军医大学学报, 2006,27(18):1661-1664.3 龚云涛，王晓民. NFkB与中枢神经系统退变性疾病J. 生命科学，2004，16(5):280-284.4 Smeyne RJ, JacksonLewis V. The MPTP model of Parkinsons diseaseJ. Brain Res Mol Brain Res, 2005,134(1):57-66.5 Marchetti B, Abbracchio MP. To be or not to be(inflamed)is that the question in antiinflammatory