末端Galβ14GlcNAc多糖分子在肿瘤患者血清中的表达(1)

1、末端Gal14GlcNAc多糖分子在肿瘤患者血清中的表达(1)               作者：邹宁,宫卫东，周媛，张积仁'【摘要】  目的 研究末端Gal14GlcNAc多糖分子在鼻咽癌、肺癌、肝癌和结直肠癌患者血清中的表达规律。方法 应用RCA（蓖麻凝集素）亲和层析法从正常人血清中获得RCA相关末端Gal14GlcNAc糖蛋白，用辣根过氧化物酶标记，采用凝集素差减法，对133例肿瘤患者，64例良性疾病患者和240例正常人血清进行检测

2、。结果 鼻咽癌、肝癌和结直肠癌患者血清中RCA识别的多糖分子明显高于正常人和良性疾病患者，阳性率分别为66.7、73.9、64.9；肺癌患者血清阳性率为19.4。且在鼻咽癌和结直肠癌患者有效治疗后该多糖分子水平显著下降，阳性率也下降。结论 血清中RCA相关的末端Gal14GlcNAc多糖分子，可用于肿瘤患者血清糖基化异常和肿瘤发病机制的研究，并可为临床诊断和治疗效果的评价提供参考指标。 【关键词】  RCA;多糖;肿瘤Investigation of Expression of the Terminal Galbeta14GlcNAc Related Polysaccharide i

3、n Serum of Malignant Tumors PatientsAbstract：Objective   To detect the expression of the terminal Galbeta14GlcNAc related polysa ccharide in serum of nasopharyngeal carcinoma,primary liver cancer,and colorectal cancer and lung cancer patients.Methods  The RCAidentifying Terminal Gal14

4、 GlcNAc glycoprotein was acquired by RCA(Ricinus communis agglutinin) affinity chromatography method from nor mal person serum and was marked by the horseradish peroxidase.133 tumor patients,64 benign disease patients and 240 normal person serums were detected by the subtraction of agglutinin.Result

5、s  The polysaccharide level of the RCAidentification in serum of  nasopharyngeal ca rcinoma,primary liver cancer and colorectal cancer was obvious higher than it in normal person and benign disease patients.The positive rate was 66.7%,73.9% and 64.9% relatively. Lung cancer had only positi

6、ve rate 19.4%. After effective therapy,the polysaccharide lever of the RCAidentification in serum of nasopharyngeal carcinoma and colorectal cancer remarkably descent,the positive rate also descent.Conclusion  The terminal Galbeta14GlcNAc related polysac haride in serum can be applied to the re

7、search of abnormal polysaccharide in tumor patient and pathogenesis. Its level can provide reference for clinical diagnosis and the evaluation on curative effect.Key words：RCA;Polysaccharide;Tumor0 引言    正常情况下，细胞膜和血清中存在凝集素识别的多糖分子，且其水平相对稳定。当细胞恶变时，多糖分子的数量和性质亦随之发生改变，并可反应在对凝集素结合的能力上。凝集素是一

8、类无免疫原性、能识别糖链结构的蛋白质，其结合的专一性类似于抗原抗体反应。用凝集素作为探针，可以检测肿瘤细胞表面、细胞内和血清中多糖水平。根据上述特性，本实验应用了能与末端Gal14GlcNAc多糖分子特异性结合的RCA3，4，亲和纯化正常人血清中末端Gal14GlcNAc糖蛋白，采用凝集素差减法检测鼻咽癌、肺癌、肝癌、结肠癌患者血清中的末端Gal14GlcNAc多糖分子表达水平，探讨其在肿瘤发生及临床中的意义。1材料和方法1.1主要试剂    RCA购自Vector公司，RCASepharose4B购自Sigma公司，辣根过氧化物酶为Roche公司进口分装。1.2

9、 血清标本收集    收集珠江医院病理确诊的肿瘤患者血清133例，鼻咽癌42，其中收集了31例鼻咽癌患者治疗前后血清，肺癌 31 例，肝癌23例，结直肠癌37例，其中33例结直肠癌患者分别收集了治疗前后血清。另收集的良性疾病血清64例均取自本院住院病人。240例正常人血清取自本院体检正常者。年龄在2076岁之间。血清收集后于-70存放，待检。1.3 方法1.3.1RCA结合糖蛋白的制备和辣根过氧化物酶标记    收集健康人血清A、B、O 3型等比混合30ml,利用2.3%利凡诺溶液与血清中的白蛋白络合形成硬块,以除去白蛋白5,将除去白

10、蛋白的液体对0.01M PBS透析,以除去其中的利凡诺分子。取上述液体分别与RCASepharose4B混合反应后，用亲和层析法纯化RCA结合糖蛋白6。将上述糖蛋白收集后，分别透析、浓缩。辣根过氧化物酶标记糖蛋白，取RCA亲和层析纯化的糖蛋白5mg，按常规方法与10mg 辣根过氧化物酶进行标记7。1.3.2血清RCA识别的多糖分子的检测    取RCA溶于凝集素稀释液中，浓度为0.0125mg/ml,包被96孔ELISA板上,每孔100l,4过夜,PBS缓冲液洗1次,分别加入检测血清100l,4反应4h,PBS洗3次,加入辣根过氧化物酶标记的糖蛋白,每孔100l,

11、4反应4h,PBS洗3次,TMBH2O2显色10min,中止反应后,酶联免疫检测仪波长450nm测OD值8。1.3.3实验对照和质控曲线的建立    取亲和纯化的糖蛋白代替检测血清做阳性对照;用PBS代替检测血清做阴性对照；用稀释不同浓度的糖蛋白代替血清做质量控制；其他步骤不变。1.3.4统计学处理    经SPSS10.0统计软件处理，采用方差分析和2检验。 1      electroretinography，F-ERG）检查，男30例，女23例；年龄2158（平均37.6）岁；右

12、眼33只，左眼40只。按照10岁为一年龄组分成4组：2029岁，20眼；3039岁，22眼；4049岁，19眼；5060岁，12眼。裸眼或矫正视力均1.0，屈光度在+1.00 -2.00之间，经裂隙灯和检眼镜检查，无屈光间质和眼底病变，无全身性疾病。    1.2方法 应用法国Metrovision 公司生产的Vision Monitor 视觉诱发系统，该仪器包括4个主要的组成部分：刺激器、放大器、计算机和打印机。刺激条件：选用高亮度、高分辨率、高刷新率的50cm彩色光电刺激器。屏幕最大亮度为300cd/m2，最小亮度<0.001cd/m2，对比度为99%。

13、以中央红点为固视点，同时配有红外摄像系统，以监视眼球的固视情况。使用的电极包括记录电极（角膜接触电极）、参考电极（盘状电极）和地电极（盘状电极）。分别置于双眼角膜，双眼外眦外2cm 处和鼻根上5cm处。检测前充分散瞳,同时暗适应30min，检测时受试者取端坐位，面对刺激屏，用地卡因表面麻醉角膜后，将角膜接触电极置于双眼角膜,参考电极置于双眼外眦外2cm处，地电极置于鼻根上5cm 处。暗适应下,分别在25dB弱光刺激下检测视杆细胞反应，在0dB强光下检测眼的最大反应和震荡电位（oscillatory potentials， OPs），明适应下，在白色标准光刺激下检测视锥细胞反应,在30Hz白色标

14、准闪烁光刺激下检测视锥细胞对快速重复刺激的闪烁光反应。    统计学处理：将原始数据输入SPSS12.0软件，应用统计学进行频数分布分析和配对t检验。    2结果    用Vision Monitor 系统测试典型的F-ERG波形由一个负向a波和一个正向b波组成，OPs是叠加在F-ERG的b波上的小波，包括3个主要的波峰OP1、OP2、OP3后面常伴有第4个相似的峰OP4，a波潜伏期是由闪光时刻到波峰的时间，a 波振幅的测量是从基线到a波波谷；b波潜伏期是由闪光时刻到波峰的时间，b波振幅是由a波波谷到b

15、波波峰；在30Hz白色标准闪烁光刺激下闪烁光反应F-ERG波形在最初的60ms内的几个反应是重叠在第一个F-ERG的b波上，以后的反应呈现与闪光频率一致的准正弦波，在记录a波和b波振幅时舍弃最初几个反应波，记录稳定后的振幅；OPs的总振幅是3个主要的波峰OP1，OP2，OP3波谷到波峰的和。在暗适应25dB弱光刺激时F-ERG波形a波的反应不明显，其后是一个缓慢上升的b波，没有次成分OPs（图1）；在暗适应0dB强光下的反应F-ERG波形由一个负向a波和一个正向b波组成，b波的上升支还可看到被称为OPs的次成分（图2）；震荡电位包括3个主要的波峰OP1，OP2，OP3后面常伴有第4个相似的峰O

16、P4（图3）；在明适应白色标准闪光刺激下的反应F-ERG波形表现为较短潜伏期的a，b波，尖锐的波形和较小的振幅（图4）；在30Hz白色标准闪烁光刺激下闪烁光反应F-ERG波形在最初的60ms内的几个反应是重叠在第1个F-ERG的b波上，以后的反应呈现与闪光频率一致的准正弦波（图5）。暗适应25dB刺激时a波无明显反应，潜伏期为40.4±6.7ms，振幅为-2.1±5.0V；b波潜伏期为110.2±11.3ms，振幅为226.7±49.2V；暗适应0dB强光下的反应a波潜伏期为26.3±1.2ms，振幅为-205.4±40.1V，b波潜

17、伏期为49.3±2.3ms，振幅为481.2±81.2V；明适应白色标准闪光刺激下的反应a波潜伏期为23.0±1.6ms，振幅为-23.4±9.1V，b波潜伏期为38.8±1.8 ms，振幅为78.1±20.7V；明适应快速重复闪烁光刺激的反应b波的振幅为122.1±27.5V，震荡电位总振幅为112.6±28.2 V。对不同年龄组正常人在暗适应25dB弱光刺激时的反应、暗适应0dB强光刺激时的反应、明适应白色标准闪光刺激时的反应、明适应快速重复闪烁光刺激的a波和b波振幅及潜伏期和振荡电位总振幅进行统计学分析（表1）：在暗适应25dB刺激时a波无明显反应；在暗适应0dB强光刺激时、明适应白色标准闪光刺激时和明适应快速重复闪烁光刺激时，a波振幅和潜伏期与年龄的增加无明显相关性，5060岁年龄