急性髓系白血病中16号染色体倒位分子病因学研究

1、    急性髓系白血病中16号染色体倒位分子病因学研究          近年来,借助于细胞遗传学和分子生物学技术肯定了染色体异常在肿瘤发生机制中的作用。16号染色体倒位inv(16)约占急性髓系白血病(AML)的15%，现认为它是AML的亚型中急性粒-单核细胞白血病伴嗜酸粒细胞增多症(M4EO)的特征性的异常核型，且提示较好的预后。随着研究的深入，已明确倒位的结果是长臂的MYH11基因与短臂的CBF基因发生融合，产生一融合基因，并在几乎所有携带inv(16)的白血

2、病患者体内检测到融合基因转录本，该融合基因可能在白血病的发生机制中起重要作用。我们将近年来各国学者对inv(16)在AML-M4EO中的分子病因学的研究作一综述。1982年Arthur和Bloomfield1首次报道了inv(16),当时描述为del(16)(q22)。他们所研究的病例临床诊断为急性非淋巴细胞白血病伴骨髓中嗜酸粒细胞增多，其中3例为M2，2例为M4。同年,在第四届国际白血病染色体会议上将此类患者归为亚型M4。在以后的几年里,其他研究者陆续证实了该亚型的存在,并发现大多数患者携有inv(16),仅少数有del(16),亦有t(16；16)2。1985年FAB分型作了修改,将那些在

3、骨髓中出现一定比例的嗜酸粒细胞的M4定为M4EO,其染色体异常有inv(16),del(16)(q22)和t(16；16)。1993年Liu等证实inv(16)的分子结果是16号染色体长臂的CBF基因与短臂的MYH11基因融合产生一融合基因。CBF基因编码的蛋白质是一称为CBF或PEBP2的DNA-蛋白质复合体的亚单位。MYH11基因编码肌球蛋白重链平滑肌型(a smooth muscle form of myosin heavy chain)。CBF蛋白的靶DNA序列是许多在造血干细胞中特异表达的基因的启动子或增强子区域,所以CBF基因是由髓系细胞转化而引起的白血病的极为关键的“转换”基因3

4、,4。1M4EO的临床特点伴有inv(16)的白血病临床诊断多为“M4EO”，亦可见于其它类型，如M2、M5、骨髓增生异常综合征(MDS)和慢性粒细胞白血病(CML)急变，少见于M1、M6、M7及急性淋巴细胞白血病(ALL)。AML-M4EO的临床特点：骨髓中粒细胞和单核细胞浸润，外周血单核细胞计数增高,骨髓和外周血中均可见嗜酸粒细胞,约占非红系细胞的5%30%,且有其独特的形态和细胞化学特性。AML中已知的几组染色体重排,包括t(8；21)(q22；q22),t(15；17)(q22；q11)和inv(16)(p13；q22)都提示有较好的预后。研究表明,inv(16)的患者对化疗较敏感,易

5、获得完全缓解,且可维持缓解5。2细胞学特点嗜酸粒细胞有特征性的染色和细胞遗传学特点,如特征性的嗜酸性颗粒,并夹杂有不成熟的嗜碱性颗粒,氯乙酸酯酶和Schiff试剂有阳性反应。目前仍不清楚是来自于白血病细胞群体还是继发性反应性增多。Adriaansen对M4EO伴inv(16)的病例进行了广泛的表面标记物的检测,表明它在细胞群的分布具有异质性。几乎所有细胞都携带CD13髓系细胞的特异标志；大多细胞CD34或CD14阳性,在某些CD34和CD14双阳性的细胞中有T细胞的标志物CD2的存在,CD2的表达与细胞的增殖能力有关6。以上的研究提示,M4EO中的白血病细胞有着与众不同的分化途径,即同时具有T

6、系和髓系细胞标记的表达。有意义的是许多T细胞特异的基因都含有可为CBF识别的启动子或增强子区域。3分子生物学特点Dauwerse、Callen、Liu等相继用粘粒、YAC探针，运用FISH等技术将16号染色体长、短臂的断裂点分别定位于16p13.11-13.3,16q223,4,7,8。Claxton等9运用逆转录-聚合酶链反应方法在几乎所有伴inv(16)的白血病患者体内检测到CBF-MYH11融合基因的转录本,并在融合部位设计了寡核苷酸引物,用Southern印迹法加以证实。CBF基因位于长臂q22,长50kb,含6个外显子,其结构在果蝇中高度保守,编码与鼠转录因子CBF(PEBP2B)同

7、源的结构域。mRNA水平分析,断裂点较恒定(nt495,nt399),常在外显子5和6之间的内含子,还可见于3端相距外显子531bp的位点,结果在外显子6造成不同阅读框架,产生不同的剪接转录本,90%为短型(182个氨基酸),保留了转录本的阅读框架；少见的为长型(187个氨基酸),不符合阅读框架。而MYH11基因位于短臂p13,断裂点变异较多,78%在nt1921,其他nt1708,nt1201,nt1098,nt99410。CBF是一主要表达于T细胞的蛋白质,可结合鼠白血病病毒(MLV)增强子的保守核心区域,其DNA顺序为PyGPyGGTPy。CBF蛋白由二个亚单位组成：亚单位可结合靶DNA

8、顺序,亚单位并不直接与DNA结合,而是通过与亚单位形成异二聚体来增加DNA-蛋白复合体的稳定性11。迄今已阐明的三种不同的亚单位皆保留一称为Runt的结构域,后者可结合DNA并能与亚单位发生相互作用。其中2由AML1基因编码,后者多在t(8；21)和t(3；21)易位中受累12。亚单位目前已知的仅一种,它并不含有任何已明确的DNA结合基序或转录激活功能域,也未发现与其它基因和蛋白质有任何的相似。但由于CBF所有编码区域在inv(16)中全部保留,故推测融合蛋白仍能与亚单位形成异二聚体,亚单位也因此介导了白血病的发生。SMMHC基因(MYH基因)是肌球蛋白家族的一员,其典型的结构：具有ATP酶活

9、性的头部,可结合肌动蛋白和主机械运动；铰链区；长尾区,由成串具螺旋-螺旋特点的结构域排列而成,有利肌丝的组装。目前的研究表明,断裂点位于尾部区域,故inv(16)的结果是其尾部的羧基末端与CBF融合形成inv(16)蛋白,后者仍能使CBF与相应DNA核心区域结合成DNA-蛋白复合体,与野生型CBF相比,它对含有核心区域基因的调控可能有两种不同的效应：“显性正”作用,增强野生型的功能；可能通过阻抑亚单位的“显性负”作用。Liu等13构建了包含全长CBF-MYH11和野生型CBF的cDNA的质粒运用于生化和遗传学研究,并根据现有的试验数据提出三种模式试解释inv(16)蛋白的功能。3.1“显性超活

10、化”(Dominant Superactivation)模型：inv(16)蛋白与野生型CBF功能相同,只是以高度活化的形式。如inv(16)可能更有效地稳定CBF与DNA的结合。另外,肌球蛋白的尾部自身也具潜在的反式激活功能域。但体内结合和转染试验不支持该假说。3.2“显性负”(Dominant Negative)模型：通过体内翻译试验,inv(16)蛋白在EMSA(electophoretic mobility shift assay)中呈现极慢的迁移率,据推测是通过肌球蛋白尾部形成高分子量结构,后者可阻断相当量的CBF，使之无法结合到靶DNA顺序。但在MMLV增强子的核心区域的突变解除了

11、inv(16)的抑制作用,提示inv(16)蛋白不是简单地阻断CBF，而是以序列特异的方式活跃地抑制启动子的转录。3.3“干扰”(Interference)模型：亚单位和inv(16)蛋白形成的复合体可能改变位于特定靶基因增强子邻近部位序列特异的转录因子的装配。MYH11长尾部干扰这些转录因子与靶DNA顺序结合。但是产生活化还是抑制效应则取决于受累转录因子的性质,即其结合区域的构象。尽管第三种模式更合理,但目前仍不能完全肯定,尚需进一步的研究来明确inv(16)蛋白在细胞中的定位,它与其它蛋白的相互作用及对靶基因的影响。综上所述,inv(16)是与AML-M4EO密切相关的异常核型,该染色体上

12、的两个基因融合产生了融合基因。随着对其研究的不断深入,它在AML发病机制中的重要作用将日益明了,这无疑对临床诊断、残留白血病的检测、预后判断还是将来治疗策略的构想方面皆具有重大的意义。参 考 文 献1Bloomfield CD,Arthur DC.Del(16)(q21 or q22) and marrow eosinophilia in acute nonlymphocytic leukemia(ANLL)：a new cytogenetic-clinical association.Proc Am Soc Clin Oncol,1982(abstr),38:191.2Le Beau MM,

13、 Larson RA,Bitter MA, et al. Association of an inversion of chromosome 16 with abnormal marrow eosinophils in acute myelomonocytic leukemia.N Engl J Med,1983,309:630-636.3Liu P,Claxton DF,Marlton P,et al.Identification of yeast artificial chromosomes containing the inversion 16 p-arm breakpoint asso

14、ciated with acut myelomonocytic leukemia.Blood,1993,82:716-721.4Liu P,Tarle SA,Claxton DF,et al.Fusion between transcription factor CBFPEBP2 and a myosin heavy chain in acute myeloid leukemia.Science,1993,261:1041-1044.5Larson RA,Williams SF,Le Beau MM,et al.Acute myelomonocytic leukemia with abnorm

15、al eosinophilias and inv(16) or t(16；16) has a favorable prognosis.Blood,1986,68:1242-1249.6Adriaansen HJ,te Boekhorst PAW,Hagemeijer AM,et al.Acute myeloid leukemia M4 with bone marrow eosinophilia(M4EO) and inv(16)(p13；q22) exhibits a specific immunophenotype with CD2 expression.Blood,1993,81:3043

16、-3051.7Dauwerse JG,Kievits T, Beverstock GC,et al.Rapid detection of chromosome 16 inversion in acute nonlymphocytic leukemia,subtype M4 regional localization of the breakpoint in 16p.Cytogenet Cell Genet,1990,53:126-128.8Callen DF,Kuss B,Willman CL,et al.Precise localization of the long arm breakpo

17、int of the inv(16) of ANLL M4EOand progress towards cloning this breakpoint.Am J Hum Genet,1992(abstr),51:A57.9Claxton DF,Liu P,Hsu HB,et al.Detection of fusion transcripts generated by the inversion 16 chromosome in acute myeloid leukemia.Blood,1994,83:1750-1756.10Hebert J,Cayuela JM,Daniel MT, et

18、al.Detection of minimal residual disease in acute myelomonocytic leukemia with abnormal marrow eosinophils by nested polymerase chain reaction with allele specific amplification.Blood,1994,84:2291-2296.11Ogawa E,Inuzuka M,Maruyama M,et al.Molecular cloning and characterization of PEBP2，the heterodimeric partner of a novel Drosophila runt-related DNA binding protein PEBP2.Virology,1993,194:314-331.12Meyers S,Downing JR,Hiebert SW,et al.Identification of AML-1 and the(8；21) translocation protein(AML-1/ETO) as sequence-specifi