检测论文阿托伐他汀对大鼠缺血再灌注脑组织中CD40L和MMP3的抑制作用

1、检测论文|阿托伐他汀对大鼠缺血再灌注脑组织中CD40L和MMP3的抑制作用    【摘要】目的：探讨阿托伐他汀对脑缺血再灌注损伤的脑保护作用机制。方法：采用Zealonga线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型血管内皮细胞间黏附分子。将Wistar大鼠随机分组：假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(IR组)、阿托伐他汀治疗组(AT组)。采用免疫组织化学法检测大鼠脑组织CD40L、金属基质蛋白酶3(MMP3)的表达。结果：AT组脑组织CD40L、MMP3表达及脑含水量和神经功能评分较IR组低(P<0.01)，而较Sham组明显增高(P<0.01

2、)。结论：阿托伐他汀可以通过抑制大鼠脑缺血再灌注后脑组织CD40L、MMP3表达，发挥脑保护作用。b【关键词】 脑缺血再灌注;金属基质蛋白酶3;CD40L;阿托伐他汀/bInhibitive action of atorvastatin on CD40L，MMP3 in ischemic brain tissue after reperfusion in ratsLI Dongfang，LI Guanglai，WANG Gaiqing，TIAN Yongqing，ZHAO Hongping，LIAN Xia，XUE Guofang(The Second Hospital of Shangxi

3、Medical University，Taiyuan 030001，China)Abstract Objective：To study the neuroprotective mechanism of atorvastatin against the injury induced by cerebral ischemiareperfusion.Methods：The middle cerebral artery was occluded with thread according to modified Zealonga&prime;s method.Wistar rats were

4、randomly divided into：shamoperation group(Sham group)，ischemiareperfusion group(IR group)，atorvastatin treatment group(AT group).The expressions of CD40L，MMP3 in brain tissues were measured by immunohistochemical methods.Results：The expressions of CD40L，MMP3，neurologicol scores，subtract brainedema i

5、n AT group were lower than those in IR group(P<0.01)，significantly higher than those in sham group(P<0.01).Conclusion：Atorvastatin can protect neural function by downregulating CD40L、MMP3 expressions during focal cerebral ischemiareperfusion.Key words cerebral ischemiareperfusion;matrix metall

6、oproteinase3;CD40L;atorvastatin阿托伐他汀是一种HMG2CoA还原酶抑制剂，除调脂作用外，还具有抗炎、抗氧化、保护内皮细胞等作用。近年来研究表明，阿托伐他汀可以通过抑制脑组织肿瘤坏死因子(TNF&alpha;)、白介素细胞1&beta;(IL1&beta;)、环氧化酶(COX)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、诱导型NO合酶(iNOS)、血管内皮细胞间黏附分子(ICAM)等炎性物质来减轻再灌注损伤。本实验借助大鼠脑缺血再灌注模型，通过观察阿托伐他汀对脑组织CD40L、MMP3表达的影响，进一步探讨阿托伐他汀在脑缺血再灌注损伤中的脑保护作用机制

7、。1 资料与方法1.1 实验动物与主要试剂及设备雄性Wistar大鼠48只，体重250350 g，购于山西医科大学生理实验室。将其分为三组：假手术组(Sham组)，阿托伐他汀治疗组(AT组)，缺血再灌注组(IR组)，每组16只，其中8只用于测脑含水量，8只用于免疫组织化学。阿托伐他汀：辉瑞制药有限公司生产;CD40L和MMP3：北京博奥森生物技术有限公司;SABC染色试剂盒、DAB显示试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司;BI2000医学图像分析系统：成都泰盟科技有限公司。1.2 动物模型制作方法参照Zealonga的改良线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型。基本步骤：大鼠于术前夜禁食;称重后，用1

8、0%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔麻醉;备皮，消毒并于颈部行25 mm纵行切口，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA);结扎ECA与CCA;于ECA与ICA分叉下方剪一切口，将一预先处理过的渔线插入CCA，经ICA入颅直到有轻微阻力感为止，插入深度为(20&plusmn;0.5) mm，实现大脑中动脉阻塞。结扎入口处，渔线外留1 cm，消毒，全层缝合伤口。2 h后提拉线头至CCA，实现对缺血脑组织再灌注，造模完成。1.3 给药方法阿托伐他汀剂量参考Oria等实验，先将阿托伐他汀用生理盐水稀释成 2.5 mg/mL以备用。IR组缺血2 h再灌注24 h，术前生

9、理盐水灌胃1周;Sham组只结扎颈内动脉和颈外动脉，不插入线，其他操作与IR组相同;AT组于术前给予阿托伐他汀10 mg&middot;kg-1&middot;d-1灌胃1周，最后1次灌胃后30 min进行实验操作。1.4 取材和指标的检测大鼠脑缺血2 h再灌注24 h，用10%水合氯醛深度麻醉大鼠后开胸暴露心脏，经升主动脉插管剪开左心耳，用生理盐水250 mL快速冲洗，迅速取脑，在4%多聚甲醛中固定6 h。用免疫组织化学法测脑组织CD40L和MMP3。每只大鼠各指标做1张免疫组织化学切片，每张随机取5个视野，分析平均光密度值，计算阳性细胞数。取平均值作为统计参数。1.5 神经

10、功能评分大鼠于再灌注后按Zea longa神经功能评分法评分：0分，无神经功能缺损症状;1分，轻微神经功能缺损，不能完全伸展左侧前爪;2分，中度局灶性神经功能缺损，向左侧转圈;3分，重度局灶性神经功能缺损，向左侧倾倒;4分，不能自发行走或意识丧失。13分为有效模型。1.6 脑组织含水量测定采用干湿重法。大鼠于缺血再灌注后，滤纸吸干脑组织表面水分，在电子天平上称得其湿重后即刻置于烤箱，100恒温烘烤24 h至恒重，精确称量干重，计算含水量。脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重&times;100%。1.7 统计学方法数据以&plusmn;s表示，采用SPSS 13.0统计软件，两组

11、间定量资料比较用t检验，神经功能评分用KruskalWallis检验，P<0.05表示差异有显著性。2 结果AT组脑组织CD40L、MMP3表达及脑含水量和神经功能评分较IR组明显低(P<0.01)，而较Sham组高(P<0.01)。2.1 免疫组织化学法脑组织CDL表达(见表1)表1 各组的CD40L阳性细胞数及平均光密度值(略)2.2 免疫组织化学法脑组织MMP3表达(见表2)表2 各组MMP3的阳性细胞数及平均光密度值(略)2.3 阿托伐他汀对缺血再灌注后神经功能评分影响(见表3)表3 各组大鼠神经功能评分(略)2.4 阿托伐他汀对缺血再灌注后脑含水量的影响(见表4)表

12、4 各组大鼠脑含水量(略)3 讨论在脑缺血再灌注损伤中，CD40与其配体组成的信号通路(CD40/CD40L)可以通过免疫细胞、内皮细胞等诱导基质蛋白酶(MMPs)、细胞因子、趋化因子等相关炎性介质的合成与分泌，促进组织损伤和细胞凋亡。MMP3与脑血管病密切相关。它不仅可以预测脑卒中，还可以影响颈动脉板块的易感性，诱发脑缺血的发生，并且MMP3还参与血管源性脑水肿(VBE)1。实验证实MMP9是VBE的重要原因2，而MMP3可激活MMP9，显然MMP3的作用更早、更重要。阻断CD40/CD40L和抑制MMP3很有实际价值。研究表明，他汀类可抑制大鼠脑缺血再灌注脑组织中ICAM1和MMP9等相关

13、炎性介质的表达;阿托伐他汀不仅可减少动脉粥样斑块内T细胞表达CD40L3，还能降低颈动脉粥样硬化患者血清sCD40L浓度4。研究中发现阿托伐他汀预干预在减轻大鼠脑缺血再灌注后脑水肿的同时还能降低脑组织CD40L、MMP3的阳性细胞数及其表达强度，提示阿托伐他汀可能通过降低缺血脑组织中CD40L和MMP3的表达来发挥脑保护作用，其可能的作用机制为：CD40L可诱导MMP3分泌，他汀可通过抑制CD40L来抑制MMP3的分泌;抑制AP1的活性从而在转录水平上抑制MMP3的产生;通过减少甲羟戊酸的产生影响了MMPs翻译后的异戊烯化修饰，从而抑制了MMP3的分泌;能减少单核巨噬细胞聚集和活化，从而使CD

14、40L与MMPs生成减少。MMP3在脑缺血损伤中的作用日趋明了，其抑滞剂如氧肟酸类ONO48175、金属铂配合物类6等虽有部分效果，但总体上生物利用度低，选择性差，很难在临床应用。虽然阿托伐他汀尚未确定是特异的CD40/CD40L与MMPs抑滞剂，但实验证实其既可阻断CD40/CD40L通路，又可抑制MMPs，并且在临床它已作为降脂药大规模应用，安全性高，有可能为治疗脑缺血再灌注损伤开辟一条新的途径。【参考文献】1杨虹，魏桂荣，李红戈.脑梗死血清MMP3与MMP9的动态变化及临床意义J.中国康复，2005，20(5)：278280.12Shigemori Y，Katayama Y，Mori T

15、，et al.Matrix metalloproteinase9 is associated with blood brain barrier opening and brain edema formation after cortical contusion in ratsJ.Acta Neurochir Suppl，2006，96：130317.13Turk U，Alioglu E，Tengiz I，et al.Statin use is associated with decreased CD40 ligand expression on T lymphocytes of coronar

16、y atheroma plaque in patients with stable coronary artery diseaseJ.Anadolu Kardiyol Derg，2008，8：99103.14解学军，李光来，李东芳，等.阿托伐他汀对颈动脉粥样硬化患者血清sCD40L水平的影响J.中国药物与临床，2008，8(4)：277279.15Takehiko Shimoyama，Noriyuki Tabuchi，Jihwa Chung，et al.Matrix metalloproteinase inhibitor(ONO4817) attenuates ischemiareperfusion injury in rat lungJ.Med Sci Monit，2006，12(2)：BR51BR56.16S