抗黄曲霉毒素B1蛋黄抗体的制备及其性质的研究

1、    抗黄曲霉毒素B1蛋黄抗体的制备及其性质的研究陈福生李根久陈九武罗信昌周启 摘要将黄曲霉毒B1-牛血清白蛋白(AFB1OBSA)连接物免疫注射4只(A、B、C、D)产蛋鸡。研究了抗AFB1蛋黄抗体的产生进程，除鸡B外，其它3只鸡从第一次注射抗原后的第90天开始有较明显的抗体产生，第135天达到高峰，从第165天开始下降。在抗体产生高峰期，蛋黄抗体A、C、D的间接ELISA效价分别为18000、16000、16000。以蛋黄抗体A为材料，研究了抗体的特异性，结果表明：该抗体有较好的特异性。但是抗体与AFB1的结构类似物(AFB2、AFG2、AFG1、

2、AFM1)除AFM1外都有不同程度的交叉反应，达到50%的竞争抑制率时，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的灵敏度分别为6、25、125和2495ng/ml。 关键词黄曲霉毒素B1抗体产蛋鸡酶联免疫分析法 中图分类号R155.31 Studies on the preparation and characters of anti-AFB1 antibody from the yolk of laying hens Chen Fusheng Li Genjiu,Chen Jiuwu,Luo Xingchang,Zhou Qi Agro-Microbiology Key Laboratorie

3、s Huazhong Agricultural University, Wuhan430070，China AFB1O-BSA conjugates were injected into four laying hens(A,B,C and D).The yolk anti-AFB1 antibodies A,C and D produced were obviously increased after 90 days of the first injection,and reached the peak after 135 days,and started dropping after 16

4、5 days.The indirect ELISA titer of yolk antibodies A,C and D were 18000,16000 and 16000 respectively.The specificity of the antibody A was good, but a cross-reaction with AFB2,AFG1,AFG2, with an exception of AFM1,was found.The sensitivities of AFB1,AFB2,AFG1 and AFG2 were 6,25,125 and 2495 g/L respe

5、ctively. Key words:aflatoxin B1, antibody, laying hen, ELISA 前文已报道AFB1抗原的构建1，本文将报道抗AFB1蛋黄抗体的制备及其性质。以自制的AFB1O-BSA连接物免疫注射产蛋鸡获得了抗AFB1的蛋黄抗体。蛋黄中的抗体是由鸡血清中的抗体转移至蛋黄中形成的，它与血清中的抗体具有相同的特异性和灵敏度。从鸡蛋中提取抗体不需采血且抗体的量较大，但是用于真菌毒素方面的研究报道甚少2。 1材料与方法 1.1试剂 AFB1OBSA连接物(免疫抗原)AFB1OBSA的摩尔比为6.31；AFB1O-OV连接物(包被抗原)AFB1OOV的摩尔比为6

6、.11，均为自制产品1。完全和非完全弗氏佐剂；黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1及邻苯二胺均为Sigma公司产品。羊抗兔IgG:HRP酶标二抗，琼脂糖，Tween-20均为华美生物工程公司产品。卡介苗为武汉生物制品公司产品。其它试剂均为实验室常用分析纯试剂。 1.2实验动物 产蛋鸡，150天龄，1.52.0kg，华中农业大学动物房提供。 1.3仪器与器材 酶联免疫检测仪ZFQ85A型，国营华中电子管厂。 1.4方法 1.4.1免疫方法 以产蛋鸡为实验动物，免疫前从鸡翅静脉采血样制备血清，与免疫抗原(AFB1OBSA)进行琼脂双向扩散实验，淘汰出现免疫沉淀带的产蛋鸡。保留不出现免疫沉淀带的产

7、蛋鸡阴性血清。在注射抗原前一周，皮内注射卡介苗以刺激免疫系统，然后每隔30d，分别于第1、30、60、90、120d各注射抗原一次，每次用量1.5ml。在第1、2次注射时与等量的完全弗氏佐剂混匀，以后各次均与等量的非完全弗氏佐剂混匀后注射。于腹部肌肉、背部皮下等处多点注射，重复数为4。 1.4.2鸡蛋黄抗体的提取2 从鸡蛋中小心分离蛋黄，10ml蛋黄液+40ml 0.1mol/L磷酸缓冲生理盐水(pH7.2)(以下简称PBS)+10ml氯仿，混匀，以4500r/min离心30min，取上清液加入PEG-8000，使浓度为14%(140mg/g)，沉淀后离心得蛋黄抗体(以下简称为IgY)，溶解于

8、10ml PBS中，再以14%(140mg/g)的PEG-8000沉淀后离心以纯化IgY，将IgY溶于10ml PBS中，此即为蛋黄抗体添加0.05%叠氮化钠，4保存备用。 1.4.3蛋黄抗体效价的测定 用间接非竞争酶联免疫吸附法(ELISA)3。 以蛋黄抗体吸光值两倍于阴性血清吸光值时蛋黄抗体的最大稀释倍数作为抗体的效价。 1.4.4抗体的特异性： 用间接竞争ELISA法4。 以竞争抑制率达到50%时所对应的毒素浓度作为灵敏度。 2结果与分析 2.1抗体的产生进程 采用多点、多次注射抗原的免疫方法免疫产蛋鸡，从第1次注射抗原后的第30天开始每隔15天收集鸡蛋，提取蛋黄抗体，按12000稀释，

9、以间接非竞争ELISA测定吸光值(A)，以A作为纵坐标，取样间隔的天数为横坐标，如图1所示得到抗体产生进程曲线。 图1抗体产生进程曲线 从图1可以看出，除鸡B外，其它鸡都能产生较好的抗体，抗原注射90天后才有较明显的抗体产生，第135天达到高峰，从第165天开始下降。 2.2抗体的效价 在抗体产生高峰期，取鸡A、C、D的蛋黄抗体(+)及其阴性血清(-)进行稀释，用间接ELISA测定效价，结果如图2。表明鸡A、C、D的蛋黄抗体效价分别为18000、16000、16000。 图2间接ELISA测定蛋黄抗体和阴性血清的效价 2.3抗体的灵敏度和特异性 本研究是以AFB1及其结构类似物，黄曲霉毒素B2

10、(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、黄曲霉毒素M1(AFM1)作为竞争抗原，对蛋黄抗体A的灵敏度进行了分析，以间接竞争ELISA中抑制率达到50%时所对应的毒素浓度为灵敏度，结果如图3。 图3蛋黄抗体A的竞争ELISA抑制曲线 图中横坐标各点所对应的毒素浓度(C)分别：0.0125，0.125，1.25，12.5，125，1250，12500ng/ml。 从图3可以得出：AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1的灵敏度分别为6、25、125、2495ng/ml和无穷大(即在图中看不出)，数值越大灵敏度越差。 抗体的特异性是以AFB1、AFB2、AFG1

11、、AFG2、AFM1的灵敏度与AFB1灵敏度的比值来表示，分别为：1、4.2、20.8、416和无穷大，数值越大特异性越差，即蛋黄抗体A的特异性按AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1为序，顺序降低。 3讨论 3.1抗体的灵敏度 灵敏度是衡量抗体质量的一个重要的指标，表示方法很多，通常是以最低检出量作为灵敏度，但是在实际应用中以最低检出量为灵敏度时存在着重复性差的缺点，这样，在相同的实验条件下在不同的实验中，同一种抗体也可能出现多个灵敏度，这显然是不合理的。本研究以间接竞争ELISA中，当抑制率达到50%时所对应的毒素浓度为灵敏度，其重复性好、运用方便。 3.2抗体灵敏度与抗原结构的

12、关系 黄曲霉毒素是结构很相似的一类化合物，它们都含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮。目前已发现并清楚化学结构的黄曲霉毒素及其衍生物、异构物多达27种，其中在食品和饲料中常见并对人畜有较大危害的主要是AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2等，它们的结构式如图4所示。根据结构式结合图3中灵敏度的分析结果，容易发现灵敏度主要与双呋喃环结构有关：图3结果表明：AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1的灵敏度分别为6、25、125和2495ng/ml；在结构上AFB2和AFB1的区别仅是AFB1的C15=C16变成了AFB2的C15C16，而AFB1的灵敏度却是AFB2的4.2

13、倍。AFM1与AFB1的区别仅是双呋喃环中的C14上多了一个羟基，使AFM1与抗AFB1的抗体不结合；AFG1与AFB1的氧杂萘邻酮有很大不同，但是双呋喃环没有差别，AFB1的灵敏度是AFG1的20.8倍，AFG2和AFB1的区别除了氧杂萘邻酮上的变化外，双呋喃环上的C15=C16变为C15C16，AFB1的灵敏度却是AFG2的416倍，其它几只鸡的蛋黄抗体与鸡A的情况基本一致。这些都说明了双呋喃环是影响灵敏度的主要因素，这与Pestka的报道相同5。 图4几种黄曲霉毒素的结构式* 引自美国农业科学技术委员会资料5 3.3抗体的特异性 抗体的特异性反映目标抗原和非目标抗原对抗体的竞争结合能力。

14、特异性可以用抗体与非目标抗原和目标抗原反应的灵敏度之比值来衡量，比值越大特异性越差。从理论上特异性越高则抗体对目标抗原的识别能力越强而与非目标抗原的交叉反应越小，这样在检测时出现假阳性的概率也越小；但是实际上即使是单克隆抗体也或多或少会与非目标抗原发生交叉反应，完全没有交叉反应的抗体是不存在的6。就真菌毒素而言，在实践中抗体的交叉反应还有一定的应用价值。Gendloff等人在制备抗T2毒素的单克隆抗体时，筛选得到了一系列产生不同特异性抗体的克隆子，他们将特异性差(即与T2毒素类似的其它镰刀菌毒素有广泛交叉反应)的抗体用于检测镰刀菌毒素的总量，而特异性较强的抗体用于分析镰刀菌毒素中的某几种或某一

15、种毒素，将这些结果综合分析，就可得到每种毒素的含量7。本研究得到的抗AFB1OBSA的鸡蛋黄抗体对AFB1有较好的特异性，同时也与AFB1的结构近似物AFB2、AFG1、AFG2、AFM1有不同程度的交叉反应，其中以与AFB2的交叉反应最明显。以蛋黄抗体A为例，AFB1的灵敏度为6ng/ml，AFB2的灵敏度是25ng/ml，这就是说以蛋黄抗体A运用竞争ELISA检测样品的黄曲霉毒素时，假设有a和b两个样品，a样品含有6ng/ml的AFB1而b样品只含有25ng/ml的AFB2，但是检测结果反映的是两样品都含有6ng/ml的AFB1，对b样品而言这是一个假象即假阳性，其实b样品只含有25ng/

16、ml的AFB2并不含有AFB1；但是从实践意义来看，25ng/ml的AFB2对人畜的危害已接近或超过6ng/mlAFB1的毒性，因而这个假阳性应该说是"合理的"，是"有应用价值的"。 * 湖北省科学技术委员会重点课题(No.962P0810) 作者简介：陈福生，男，博士，讲师 李根久湖北省农业科学院，430064 作者单位：华中农业大学农业微生物重点实验室，武汉430070 参考文献 1.陈福生，李根久.黄曲霉毒素B1抗原的构建.卫生研究，1998，27(增刊):133137 2.Clarke J R,Marquardt R R ,Oosterveld,

17、et al.Development of a quantitative and sensitive ELISA for Ochratoxin A using antibodies from the yolk. J Agric Food Chem,1993,41:17841789 3.程知义，周佳敏 编著.医用实验病毒学，北京：人民军医出版社，1981,69120 4.Tsai G L,Cousin M A.Partial purification and characterization of mold antigens commonly found in food.Appl Envirom Microbiol,1993,8:26632571 5.Pestka J J,Gaur P K,Chu F S.Quantitation of aflatoxin B1 and aflatoxin B1 antibody by an Enzyme-Linked lmmunosorbent Microassay.Appl Envirom Microbiol,1980,10271031 6.Pestka J J