抗CD28抗体协同刺激增强抗CD3抗体体外激活T淋巴细胞并降低TGF-β的表达

1、抗CD28抗体协同刺激增强抗CD3抗体体外激活T淋巴细胞并降低TGF-的表达                        作者：骆群，吕明，于鸣，黎燕【摘要】  为了探讨体外激活T淋巴细胞的方法及活化后T淋巴细胞的免疫学特征，利用抗CD3、抗CD28抗体在体外刺激健康人外周血单个核细胞PBMNC，检测淋巴细胞转化，CD8+CD25+细胞比例和肿瘤生长因子（

2、TGF-）表达等相关免疫学指标。结果表明，在抗CD28抗体的协同作用下，抗CD3抗体的刺激活性明显提高，CD8+CD25+细胞比例明显增加，TGF-的表达下调。结论： 抗CD28抗体协同刺激可以提供第二信号，使T淋巴细胞充分活化，TGF-表达水平明显下降 【关键词】  抗CD3抗体Anti-CD28 Antibody Costimulation Enhances Anti-CD3 antibod   Activating T Cells  and  Lowering  TGF- Expression   in Vi

3、troAbstract  In order to study how to activate  T cells and their immunological characteristics，the anti-CD3 and anti-CD28 McAbs were used  to stimulate PBMNC，then  their related immunological changes，such as  lymphocyte transformation function，the percentage of CD8+CD25+ ce

4、lls and     TGF- expression  were delected  by lymplocyte transformation assay，flow cytometry and RT- PCR respectively.  The results showed that  in  costimulation with anti-CD28 antibody stimulathetion，the  activity of anti-CD3 antibody  was si

5、gnificantly enchanced，the ratio of CD8+CD25+ cells of T cells was obviously increared，while TGF- expression  was down-regulated. It was concluded that the anti-CD28 antibody costimulation could  provide  stimulatory signal ，which  make T cells more active，while the expression of

6、TGF-   significantly  down-regulated.Key words anti-CD3 antibody; anti-CD28 antibody;TGF-;T cell    T淋巴细胞在人体免疫系统中扮演重要的角色，其在体内处于抑制或耐受状态会导致免疫力下降，从而引起感染与肿瘤等发生。近年来人们一直探讨体将外诱导活化的T淋巴细胞用于过继免疫治疗。T细胞活化需要TCR/CD3识别APC表面的MHC-肽复合物提供的第一信号以及CD28/B7、LFA-1/ICAM-1等协同刺激分子相互作用提供的第二信号。目前国内外

7、多用抗CD3抗体体外激活T细胞，将CD8+CD25+杀伤性T淋巴细胞回输治疗免疫力下降引起的感染与肿瘤1，2。但是研究表明，T淋巴细胞在接受第一信号之后，如果不能接受第二信号的刺激，则将迅速呈低反应性或失能。在抗CD3抗体体外激活T淋巴细胞的同时，提供第二信号对T淋巴细胞的活化以及后续的体内回输治疗具有重要意义。T淋巴细胞表面的协同刺激分子CD28与其配体B7的相互作用是为T淋巴细胞活化提供第二信号的主要途径之一，近年来已有报道利用抗CD28抗体协同抗CD3抗体体外扩增活化T淋巴细胞3，4。    抗CD3抗体刺激T淋巴细胞后，会介导T淋巴细胞分泌TGF-。近年来

8、研究提示，TGF-在介导体内长期免疫耐受的过程中起着关键性作用5，6。作为一个有效的免疫抑制因子，TGF-可使肿瘤细胞逃避宿主的免疫监视，成为肿瘤的一道屏障，这可能是过继性免疫治疗肿瘤后易复发的一个重要原因7-9。    本研究在抗CD3抗体体外模拟T淋巴细胞活化的第一信号的同时，利用抗CD28抗体模拟第二信号协同激活T淋巴细胞，增强了抗CD3抗体体外活化T淋巴细胞的功能；与此同时，研究发现在抗CD28抗体协同刺激下TGF-的表达水平出现明显地下降。材料和方法材料人外周血取自体检合格的献血者。人淋巴细胞分离液（比重1.077±0.002）购自Amersh

9、am Bioxciences公司。抗CD3单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体由军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室提供。FITC标记的抗CD8、PE标记的抗CD25抗体购自Becton Dickinson公司。3H-TdR购自中国原子能研究所。RPMI 1640培养液购自Gibco公司。TGF- ELISA检测试剂盒购自Becton Dickinson公司，TrizoL购自Invitrigen公司。方法PBMNC分离 取正常人外周血，用肝素钠抗凝，生理盐水2倍稀释后小心加入等体积的淋巴细胞分离液（=1.077g/mL），2 500×g离心20分钟，取中间单个核细胞层，生理盐

10、水洗2遍，用含10% FCS的RPMI 1640培养液制备成浓度为1×106/ml的单个核细胞悬液备用。淋巴细胞转化试验 分离人外周血单个核细胞（PBMNC），调整细胞密度为1×109/L，加入96孔板，100 l/wall。加入相应浓度的CD3抗体（2 g/ml）、CD28抗体（5 g/ml），设三个复孔，并设PBS阴性对照孔，于5%  CO2、37培养56小时。加3H-TdR（1 mCi/ml ）0.5 Ci/wall，继续培养16小时。收集细胞并于液体闪烁仪上计数cpm值。计算刺激指数（SI）= （实验组cpm值-本底值）/（阴性对照组cpm值-本

11、底值）。     细胞亚群的FACS分析 收集PBMNC，用含2% FCS、0.2 g/L叠氮钠的10 mmol/L PBS洗3次；加入相应抗体，以PBS为阴性对照，冰浴振荡30分钟； 3 400×g离心30秒，收集细胞，将细胞洗3遍后用10 g/L的多聚甲醛固定。用FACS Calibur流式细胞仪检测分析。RNA的提取  收集PBMNC，PBS洗涤记数。按1×106/ml浓度细胞加入TrizoL ，剧烈震荡裂解细胞。室温静置5分钟后，每1ml TrizoL 加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温静置10分钟

12、。将Eppendorf管置于高速台式冷冻离心机，4，13 400×g离心15分钟。小心吸取上层液相置于另一无菌Eppendorf 管中，加入等体积异丙醇，室温沉淀10分钟。4，13 400×g离心10分钟，弃上清，沉淀用75乙醇洗涤1遍，沉淀的RNA在室温自然干燥。用30 l无RNA酶的DEPC水重悬干燥后的RNA。电泳分析以及分光光度计定量，用于下一步实验或-70长期保存。cDNA逆转录 取约含1 g稀释的RNA溶液，加入Oligo(dT) 1 l，70孵育5分钟，迅速放入冰中冷却，依次按说明书加入2.5 mmol/L dNTP、5×反转录缓冲液、AM

13、V反转录酶、RNA酶抑制剂，DEPC水。将上述反应物混匀后，42反应60分钟，95 5分钟灭活反转录酶，获得的cDNA置-20保存备用。TGF-表达水平的半定量PCR测定 利用Biosun核酸分析软件，分析TGF-基因的全序列，获得特异性的区间，设计特异性的引物。取等量的各组cDNA为模板，以GAPDH做为内参照，用半定量的方法测定TGF-的表达水平。PCR条件如下：94预变性5分钟后；开始下列循环：94变性30秒，55退火30秒，72延伸30秒，扩增30个循环；最后72延伸7分钟。2%琼脂凝胶电泳分析，利用Labworks软件对PCR结果条带进行灰度分析，以内参照GAPDH为对照，

14、计算不同抗体条件刺激下的TGF-的表达情况。细胞培养上清中TGF-水平的ELISA分析 按说明书的操作步骤，将TGF-抗体溶解于包被液（碳酸盐缓冲液pH 9.6），浓度为4 g/ml，100 l/wall包被ELISA  96孔板，4过夜后，用10 g/L的BSA 37封闭2小时，用PBST（PBS+0.1%吐温20）洗涤3遍；按100l/wall加入各条件刺激下的PBMNC细胞培养上清，37孵育1小时，用PBST洗涤3遍；按100l/wall加入biotin-抗TGF-抗体，37孵育1小时，PBST洗涤3遍；avidin-辣根过氧化酶(a-HRP)50l/wall，室温放

15、置45分钟，PBST洗涤5遍。OPD显色，于492 nm处测吸收值；以标准的TGF-做标准曲线，计算各培养上清中TGF-含量。统计学处理应用SPSS软件分析结果，数据用均数±标准差（x±SD）表示，组间比较采用配对t检验，P<0.05为有统计学差异。结果抗CD28抗体协同抗CD3抗体激活T淋巴细胞3H-TdR 掺入实验结果显示，抗CD3抗体在体外可以激活T淋巴细胞，其刺激指数为16.1。单独的抗CD28抗体没有明显的刺激活性；但是在抗CD28抗体的协同作用下，抗CD3抗体的刺激活性明显提高，其刺激指数达到25.9（表1）。Table 1. Enhancing effe

16、ct of anti-CD3/28 on lymphocyte transformation activity (SI) (略)抗CD28抗体协同抗CD3抗体增强淋巴细胞转化活性在实验浓度的抗体刺激后，收集细胞，分析激活后的细胞中CD8+CD25+细胞亚群的变化。结果显示，抗CD3抗体刺激后的细胞中CD8+CD25+细胞由PBS对照组的3.98±0.23%增加到12.3±2.36%；而单纯的抗CD28抗体却没有明显的淋巴细胞转化功能（4.03±0.95%）；但是，在抗CD28抗体协同刺激作用下，抗CD3抗体的淋巴细胞转化功能显著提高，协同刺激后CD8+CD25+细

17、胞所占的比例增高至19.3±1.23%。在抗CD28抗体协同刺激下，抗CD3抗体激活淋巴细胞以及促淋巴细胞转化的功能显著提高（表2，图1）。Table 2. Percentage  of CD8+CD25+ cells  in total transformed cells by flow-cytometry  (略)TGF-表达水平的半定量PCR测定结果利用biosun核酸分析软件分析TGF-基因全序列，获得特异性的区间，设计特异性的引物，上游引物为：5-GTTCAAGCAGAGTACACACAGCATATAT ATGTTCT-3；下游引物为5-GGA

18、GGGGAAATTG AGGGCTTTCGCCTTAGCGC-3；扩增区间为TGF-基因738-1031片段，长为293 bp，可以在凝胶电泳上与内参照 GAPDH 扩增产物 350 bp 的条带明显区分，可用于下一步的半定量实验。收集各条件刺激后的PBMNC，提取总RNA后，在基因水平上利用RT-PCR的方法分析TGF-的表达水平，以TGF-条带灰度/GAPDH条带灰度作为分析指标。结果显示，CD3抗体刺激后TGF-的表达水平明显上升，由PBS对照组的0.036±0.005上升至0.195±0.054。CD28抗体协同作用后，TGF-的表达水平下降至0.135±

19、0.031（表3，图2）。Table 3. Ratio of TGF- and GAPDH (略)     细胞培养上清中TGF- 水平的ELISA分析结果TGF-在免疫调节过程中具有重要意义，通过半定量RT-PCR的方法测定其在基因水平的表达情况后，通过ELISA的方法分析其在蛋白水平表达情况。结果与半定量RT-PCR结果一致，CD3抗体刺激后，TGF-的表达水平与PBS组相比明显上升。而CD3抗体与CD28抗体协同作用后，TGF-的表达水平明显下降（图3）。讨论T细胞在机体免疫系统中起着关键作用，它不仅有直接的免疫效应功能，同时通过产生多种细胞因子及

20、表达黏附分子与其他免疫细胞的直接或者间接接触，发挥广泛的免疫调节作用。正因为如此，T细胞与临床上许多疾病的发生发展有着直接的或间接的关系，因此它在免疫相关疾病的诊断、预防和治疗方面的应用倍受重视。研究显示，感染及肿瘤的发病与机体T细胞的功能低下或者耐受有着密切的关系。近年来人们一直探讨将体外诱导活化的T淋巴细胞用于过继免疫治疗。国内外已有报道，利用体外容易得到的人PBMNC，通过抗CD3抗体体外扩增活化T淋巴细胞，将激活表型为CD8+CD25+的杀伤细胞回输治疗免疫力下降引起的感染与肿瘤1，2。    抗CD3抗体可特异地识别T细胞表面的CD3分子，并通过激活T细

21、胞表面TCR-CD3复合物与APC表面MHC-类分子-抗原肽的结合，使T细胞活化并增殖。但是T淋巴细胞在其全面活化过程中不仅需要T淋巴细胞受体（TCR）/CD3复合物的第一信号，还需要第二信号来增强T淋巴细胞的活化与增殖。一般认为，T淋巴细胞在接受第一信号之后，如果不能接受第二信号的刺激，则其在活化后处于低反应性或失能状态，很快便进入了凋亡。临床实验也证实，抗CD3抗体活化后的T淋巴细胞回输后，很快进入凋亡状态。T淋巴细胞表面的协同刺激分子CD28与其配体B7的相互作用是为T淋巴细胞活化提供第二信号的主要途径之一。如果可以在体外利用抗CD3抗体刺激提供第一信号的同时，用抗CD28抗体协同刺激提

22、供第二信号，就可以使T淋巴细胞充分活化。    本研究利用抗 CD28 抗体模拟第二信号协同抗 CD3 抗体在体外对外周血淋巴细胞进行活化扩增。用3H-TdR掺入法测定抗体，结果表明，单独的抗CD28抗体对PBMNC没有明显的激活活性，但是在抗CD28抗体的协同作用下，抗CD3抗体的激活活性明显提高，其激活指数由16.1提高至25.9。同时，流式细胞仪检测结果显示，在抗CD28抗体的协同刺激下，抗CD3抗体使淋巴细胞的转化功能得到了显著提高，CD8+CD25+细胞所占的比例由12.3±2.36%增高至19.3±1.23%。  

23、;  抗CD3抗体刺激T淋巴细胞后，会介导T淋巴细胞分泌TGF-。近年来研究提示，TGF-在介导体内长期免疫耐受的过程中起着关键作用5，6。作为一个有效的免疫抑制因子，TGF-可使肿瘤细胞逃避宿主的免疫监视，成为肿瘤的一道屏障，这可能是过继性免疫治疗肿瘤后易复发的一个重要原因7-9。本研究中，利用半定量RT-PCR的方法以及ELISA方法分别从基因和蛋白水平对各种刺激条件后TGF-的表达水平进行了测定，CD3抗体刺激后，TGF-的表达水平明显上升；但是在抗CD28抗体协同作用后，TGF-的表达水平明显下降。近年来的研究提示，TGF-可以协同CD4+CD25+等Treg细胞介导免疫耐受

24、，它的分泌可能与这些细胞相关10-12，而CD8+CD25+细胞可能会抑制CD4+细胞的活性13。本实验中抗CD28抗体协同刺激后TGF-的表达下调可能与CD8+CD25+细胞相关。    本研究通过体外实验证明，抗CD28抗体的应用可以提供T细胞充分活化所必需的第二信号作用，协同抗CD3抗体激活T淋巴细胞，同时降低抗CD3抗体刺激后TGF-的表达水平。本实验建立了体外活化T淋巴细胞的扩增方法，为研究T淋巴细胞免疫应答机理建立了细胞模型。【参考文献】  1Flens MJ，Mulder WM，Bril H，et al. Efficient expansi

25、on of tumor-infiltrating lymphocytes from solid tumors by stimulation with combined CD3 and CD28 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother，1993; 37: 323-3282陈宝安，陈苏宁，李翠萍等. 自体及异体CD3单克隆抗体激活杀伤细胞对正常造血细胞的影响.中国实验血液学杂志，2001； 9:338-3423曲梅花. CD28/B7共刺激信号及其临床意义. 中国实验血液学杂志，2002;10: 265-2674Garlie NK，LeFe

26、ver AV，Siebenlist RE，et al. T cells co-activated with immobilized anti-CD3 and anti-CD28 as potential immunothe- rapy for cancer. J Immunotherapy，1999; 22: 336-3455Ramireddy R，Doctschman T. TGF-b，T-cell tolerance and anti-CD3 therapy. Trends Mol Med，2004;10:3-9     6陈健琳，郭子宽，徐晨等.

27、间充质干细胞分泌TGF-1抑制异体T细胞反应性. 中国实验血液学杂志，2002；10:285-2887Suarez-Pinzon WL，Marcoux Y，Ghahary A. Gene transfection and expression of transforming growth factor-1 in nonobese diabetic mouse islets protects -cells in syngeneic islet grafts from autoimmune destruction. Cell Transplant，2002;11: 519-5288Green EA，Gorelik L，McGregor CM，et al. CD4+CD25+ T re- gulatory cell control anti-islet CD8+T cells th