拟南芥rd29A启动子的克隆及其在甘蔗抗逆转基因中的应用初探

1、 拟南芥rd29A启动子的克隆及其在甘蔗抗逆转基因中的应用初探1张积森、廖辉煌、林晓坤、陈如凯、张木清2(福建农林大学农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点实验室,福州350002摘要:从拟南芥(Arabidopsis thaliana基因组DNA克隆了长度为420bp的rd29A基因启动子,序列分析表明该启动子具有两个干旱、高盐和低温响应顺式作用元件(DRE,其它主要调控区域也存在。用rd29A启动子构建了具有绿色荧光蛋白(GFP基因的植物表达载体,通过基因枪导入法转化甘蔗愈伤组织,在转化后3d和5d,NaCl胁迫条件下,用荧光显微镜观察GFP基因在愈伤组织表达水平.结果表明rd29A启动子是Na

2、Cl诱导型启动子,可满足在盐胁迫条件下使目的基因在转基因甘蔗中进行表达的目的。关键词:甘蔗;rd29A;gfp;抗逆Cloning of rd29A Gene Promoter from Arabidopsis thaliana and ItsPreliminary Application in the Sugarcane Transformation of StressresistanceZhang J.-X., Liao H.-H., Lin X.-K., Chen R.-K. and Zhang M.-Q.(Key Lab of Eco-Physiology & Genetic

3、Improvement for Sugarcane under Ministry of Agriculture, Fujian Agri. & Forestry Univ., Fuzhou, 250002Abstract :The 420 bp region of rd29A gene promoter from Arabidopsis thaliana genome was amplified by PCR technique. Sequence analysis showed that the fragment contained two cis-acting elements i

4、ncluding dehydration responsive elements (DRE and ABA responsive elements (ABRE and the main regulation motifs. The plant expression vector pPrd-S65T was constructed with this fragment linked up with green fluorescent protein (GFP gene controlled by rd29A promoter, which was transferred to sugarcane

5、 callus by bombardment microprojectiles. The expressions of gfp in the transformed sugarcane callus treated with 250 mmol/L NaCl for3 days and 5 days, were detected by fluorescent microscope.The result indicated that the cloned rd29A promoter could be applied in the transgenic sugarcane for the stre

6、ss resistance.Key words : sugarcane; rd29A gene promoter ;green fluorescent protein (GFP gene ; Stress resistance1基金资助:国家“863”计划课题糖料新品种选育课题(2001AA241191;国家自然科学基金(30370901以及教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(200403890092通讯作者(Author for correspondence: 张木清(1966-、男,福建周宁人,汉族、博士、博士生导师、教授,主要研究方向:作物生理遗传与分子育种。通讯地址:福州金山福建

7、农林大学甘蔗综合研究所,350002, zmuqing,电话:0591-* .干旱、高盐、冷害等逆境胁迫严重影响作物的生长和产量,为了适应这些逆境变化,作物在长期自然选择条件下,形成了多种适应机制。植物在逆境条件下,会发生某些基因的表达,以调节自身对不利环境的适应。国内外科研工作者在逆境胁迫诱导基因表达、基因调控以及信号转导等方面做了大量的工作1-4。Yumaguchi-Shinozaki K等从干旱处理的模式植物拟南芥中克隆了一批受干旱诱导的基因,定名为rd(responsive to dehydration基因5。其中rd29A基因的表达,不仅受高盐胁迫诱导,也受低温胁迫的诱导,分析其启动

8、子,发现有一个与干旱、高盐及低温胁迫应答有关的DRE顺式作用元件,对阿拉伯芥和烟草进行的研究表明,rd29A至少有2个顺式作用元件,一个对干旱胁迫和ABA诱导联合响应,另一个是由渗透压的改变而诱导的6-7。但rd29A基因目前在甘蔗转基因上应用还未见报道。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,简称GFP是海洋生物水母(Aequorea victoria 体内的一种发光蛋白,分子量27KD,由238个氨基酸组成。该蛋白65-67 位Ser-Tyr-Gly 三种氨基酸环化加氧形成特殊的生色团结构,这一氧化和环化过程不需要任何外源底物或辅因子8。因此GFP 作为报道基因具

9、有稳定性好、可以在多种异源细胞表达、对宿主细胞无毒害、荧光易于检测等诸多优点9。但野生型绿色荧光蛋白(wtGFP荧光强度较弱,而S65T 作为wtGFP 的一个突变体,其生色团形成速度比野生型GFP 快4 倍,荧光强度提高了几十倍10,目前GFP 及其突变体作为新的报告基因和遗传标记已被广泛应用于植物研究中。本研究利用GFP突变体S65T作为报告基因,与克隆的RD29A启动子构建表达载体,用基因枪介导转入甘蔗愈伤组织,研究其在盐胁迫下对外源基因的控制表达,为rd29A在甘蔗抗逆基因工程中的应用研究提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株:大肠杆菌(E.coliDH5由本实验室保存。1

10、.1.2植物材料:转化的甘蔗品种福农95-1702为福建农林大学甘蔗研究所新培育的新品种;克隆拟南芥干旱诱导启动子rd29A所用的拟南芥(Arabidopsis thaliana哥伦比亚生态型由福建农林大学植保学院王宗华教授提供。 1.1. 3主要生化试剂:限制性内切酶购自Promega 公司;T4-DNA连接酶,Ex Tag DNA 聚合酶,Pyrobest Tag DNA 聚合酶,PCR 片段回收试剂盒、IPTG、X-Gal 购自宝生物(大连;引物合成、测序工作由上海生物生工工程有限公司完成;DNA Marker,dNTPs 混合物购自上海生物工程有限公司;其它试剂购国产分析纯试剂。1.2

11、方法1.2.1拟南芥干旱诱导启动子RD29A的克隆用CTAB 法11提取拟南芥( Arabidopsis thaliana (Columbia 生态型幼叶总DNA。根据Yamaguchi Shinozaki 等6所发表的rd29A 基因启动子的序列,设计了一对特异引物(P1: -GCAAGCTTTCGAATGAGAAGGATGTGCCG-3P2: 5-CCTCTAGATCCAATAGAAGTAATCAAACCCT-3 ,由上海生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增反应体积为50L , 包括0.5g DNA 模板,5L 10 ×buffer ,2L dNTPs (2.5 mmol P

12、 L ,1L 引物P1 (20 mmol P L ,1L 引物P2 (20 mmol P L ,0.25L Pyrobest TM DNA 聚合酶,补ddH2O至50L。反应条件为94 预变性5 min ;94 ,45 s ,55 ,40 s ;72 ,1 min ;35 个循环后于72 保温延伸5 min。PCR结束后取10µL扩增产物,于1%的琼脂糖凝胶电泳。回收PCR反应产物,进行目的片段与pMD18-T载体的连接,然后转化大肠杆菌DH5,(抗生素为100mg·L-1Amp挑单菌落进行重组质粒的鉴定。克隆的PCR产物序列由上海生工生物工程公司测定。测序结果用PCgen

13、e软件进行序列分析。1.2.2植物表达载体p Prd-S65T的构建及转化将pMD18T- Prd 29A中的目的片段(p rd29A连接到UBI1-S65T中。即纯化的含pMD18T- Prd 29A质粒用HindIII和BamHI双酶切,低熔点琼脂糖凝胶电泳,回收小片段;UBI1-S65T也用HindIII和BamHI双酶切,低熔点琼脂糖凝胶电泳,回收大片段。对UBI1-S65T回收大片段和pMD18T-Prd29A回收小片段在T4-DNA Ligase的作用下连接,再转化DH5,提取质粒,用HindIII和BamHI双酶切鉴定阳性克隆pPrd-S65T(如图1。 图1植物表达载体p Pr

14、d-S65T构建图Fig.1 Diagram of the construction of plant expression vector p Prd-S65T1.2.3基因枪转化:在基因枪轰击前先将甘蔗受体材料转入JDA培养基(MS+2,4-D 3.0 mg·L-1中预培养2d,然后转入含渗透剂0.2 mol/L 甘露醇和0.2 mol/L 山梨醇的JDA培养基中预处理46 h后,无菌条件下进行基因枪轰击。1.2.4 p Prd-S65T转化愈伤的荧光检测转化愈伤组织的胁迫培养:轰击后的愈伤组织仍放回预处理培养基(JDA+Sorbitol 0.2 mol/L + Mannitol

15、0.2 mol/L上继续处理18h,其后分别接入JDA培养基、PEG胁迫培养基(MS+2,4-D 2 mg/L+PEG 6g/L、NaCl胁迫培养基(MS+2,4-D 2 mg/L+0.8%NaCl ,每种培养基上分别接200个愈伤组织,25暗恢复培养38 天。荧光显微照相分析转化愈伤: 取少量转化的愈伤于清洗后的载玻片上,置于荧光显微镜物镜位置,首先在普通显微下找到清晰的愈伤视野。激发汞灯,调节滤光片组成,分别用不同波长激发光(绿光、紫外光、蓝光照射,观察愈伤有无荧光产生。选用不同物镜,分别选择不同视野下观察,选择最佳观察效果。2结果分析2.1 rd29A基因启动子的克隆与序列分析2.1.1

16、rd29A基因启动子的克隆 以提取到的植物材料总DNA为模板,PCR扩增片段约为0.4 kb 左右(如图2。PCR产物连到pMD18-T载体后在含X-gal和IPTG的固体培养基上长出区别分明的蓝白菌斑。分别提取蓝白菌落质粒,经电泳可见重组质粒滞后明显, HindIII+BamHI酶切鉴定,如图3,可见一0.4 kb左右的条带,与预期相符。 图2 PCR产物电泳鉴定图Fig.2 The PCR fragments of rd29A gene PromoterM:Generuler TM 100bp DNA lander plus;1,3:PCR产物;2:空白对照M:Generuler TM 1

17、00bp DNA lander plus; 1,3 the produce of PCR amplication 2:Blank control 图3 pMD18T-Prd29A/HindIII+BamHI酶切电泳鉴定图Fig.3 pMD18T-Prd29A digested by Hind III and BamHIM:Generuler TM 100bp DNA lander plus;1:pMD18-T/HindIII+BamHI;2:重组质粒/HindIII+BamHI;3:pMD18T-Prd 29A PCR扩增片段;4:重组质粒/HindIII M:Generuler TM 100

18、bp DNA lander plus;1:pMD18-T/HindIII+BamHI;2:pMD18T-Prd29A/HindIII+BamHI;3:The PCR fragments of pMD18-T-Prd29 amplification by P1 and P2 primes;4:pMD18T-Prd29A/HindIII2.1.2rd29A基因启动子序列分析经序列测定,启动子序列全长420 bp(图4,与已发表的序列完全一致。PCgene软件分析结果表明:序列的第26到32碱基为-10区,第150到第157碱基为-35区,序列的第327到第331碱基间有5 bp的TATA盒(TAT

19、AA,在第7081碱基间有一12 bp的CAAT盒和富GC区(ATGGGCCAATAG,在第317到325碱基间有一8 bp的戴帽信号(TCAGTCTC,干旱响应顺序作用元件 (DRE-TACCGACTA-位于第136145碱基之间,ABA应答因子ABRE位于297-304碱基之间。TCGAATGAGAAGGATGTGCCGTTTGT TATAAT AAACAGCCACACG ACGTAAACGTAA AAT 60-10GACCACATGAT GGGCCAAT AGACA TGGACCGACTACTAATAATAGTAAGTTACATTTTAG 120GC-box CAAT-boxGATGGA

20、ATAAATATCA TACCGACAT CCCT TTGAAA GTTTTTTATTTATTTTCTAAACTAA 18020bpDRS-1 -35A TAAAAGA TATAC TACCGACAT GAGTTCCAAAAAGCAAAAAAAAAGATCAAGCCGACACA 24020bpDRS-2GACACGCGTAGAGAGCAAAATGACTTTG ACGTCA CACCACGAAAACAGACGCTTCATACG 300As1 ABRE TGTCCCTTTATCACTCTCAGTCTCTC TATAA ACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTTTTACTC 360Cap sig

21、nal TATA-boxACAAATATGCAAACTAGAAAACAATCATCAGGAATAAAGGGTTTGATTACTTCTATTGGA 420图4 Prd29A核苷酸序列及其元件Fig.4 The nucleotide sequence and the elements of rd29A gene promoter( 20bpDRS:20bp正向重复序列,其中黑体碱基序列为脱水响应元件; As1:类根特异表达的激活序列;ABRE:类ABA响应元件(20bpDRS:20bp reverse repeat sequences;The black symbol for the dehydr

22、ation responsive element As1:similarity to responsive sequence of special express in the root; ABRE:Similarity to ABAresponsive element 2. 2p Prd-S65T质粒的构建与鉴定构建好的pPrd-S65T载体利用HindIII和BamHI进行双酶切,凝胶电泳。如图5,1、2切出片段约为0.4kb,与预期一致,说明rd29A基因片段已经插入并连接到载体上,片段大小和位置完全正确。 图5 p Prd-S65T/HindIII+BamHI酶切电泳鉴定图Fig.5

23、p Prd-S65T digested by Hind III and BamHIM:Generuler TM 100bp DNA lander plus;1:p Prd-S65T PCR扩增片段;2:重组质粒/HindIII+BamHI;3:重组质粒/HindIII;4:UBI1-S65T /HindIII+BamHI M:GenerulerTM 100bp DNA lander plus;1:The PCR fragments of pPrd-S65T amplification by P1 and P2 primes 2:p Prd-S65T/HindIII+BamHI;3:p Prd-

24、S65T/HindIII;4:UBI1-S65T /HindIII+BamHI2.3 p Prd-S65T质粒遗传转化甘蔗及逆境胁迫下的荧光检测基因枪法将p Prd-S65T质粒转化甘蔗二代愈伤,一共轰击了800个愈伤。愈伤胁迫培养3d后,分别取三种培养基上培养的转化愈伤组织进行观察,结果发现在蓝光激发下,只有在加有NaCl的胁迫培养基上的转化愈伤有发出绿色荧光,发射波长为511nm,且数量较少,仅有几个荧光点;而在同样激发波长下,用其余的胁迫培养基上的转化愈伤和对照非转化愈伤进行扫描,则只有绿色背景,无任何荧光发出,这证明愈伤是经转化后,并且受到NaCl胁迫才发出511nm 波长荧光。而在愈

25、伤胁迫5天后继续进行观察结果,发现NaCl的胁迫培养基上的转化愈伤绿色荧光数量增加了1倍,而其余的胁迫培养基上的转化愈伤和对照非转化愈伤仍然没有荧光出现,如图6。这些说明所构建的p Prd-S65T植物表达载体已转入愈伤组织中,且rd29A启动子在受到NaCl胁迫时,可以诱导S65T 表达。 NaCl胁迫3d 对照Transgenic plant treated with 250 mmol P L NaCl for3 days Negative control of non-transformed plant NaCl胁迫5d 对照Transgenic plant treated with 2

26、50 mmol P L NaCl for 5 days Negative control of non-transformed plant图6 GPF基因在NaCl胁迫下的诱导表达Fig.6 The expression of GFP gene induce by the NaCl4讨论已有的研究表明,逆境诱导的基因所具有的启动子调控元件包括ABRE ( PyACGTGGC 、G2BOX ( CACGTG 、DRE( TACCGACAT 、MYBRS ( PyAACPyPu 、MYCRS(CANNTG等,并且还有很多结合调控元件的调控蛋白诸如bZIP , MYB、MYC、VP1、MAPK 和R

27、SK等12-13。本研究所克隆的rd29A基因启动子序列中包括了若干对ABA 和缺水应答的ABRE、DRE 等顺式作用元件。对启动子序列各种作用元件的分析可知,该启动子有效的诱导作用位点大多集中在- 400bp 范围内。rd29A 是诱导型启动子,包含有比较保守的顺式作用元件,利用这些保守元件可以推测新基因的可能功能,也可以与抗逆基因融合,从而使转基因植物更好的适应逆境,也适合于对特定条件下基因尤其是外源基因表达的研究。植物不含内源GFP,而GFP 能自动催化形成荧光基团,无需反应底物或辅助因子,就可以直接观察GFP 融合蛋白的表达,所以不会出现像GUS一样的假阳性结果,且能准确反应转化结果9

28、。因而选用gfp为报告基因,可以在愈伤培养阶段就进行转基因植株的初步鉴定。在组培条件下,rd29A 控制gfp基因在愈伤组织表达,在胁迫时间上也具有差异。盐胁迫5天的gfp表达量较3天多1倍,这证实了拟南芥逆境诱导型启动子rd29A的功能。rd29A这个启动子没有器官专一性,受干旱、寒冷、盐等胁迫的诱导7。在NaCl处理下,rd29A驱动的gfp基因在甘蔗愈伤组织表达,说明rd29A受盐胁迫诱导驱动下游基因表达,也证明了该启动子可以在愈伤组织表达。在后继研究中,将对成苗后的转基因植株进行PCR和Northern blot鉴定,以进一步研究不同逆境胁迫下,在rd29A驱动下的gfp基因表达。参考

29、文献1 Seki M, Narusaka M, Abe H, Kasuga M, Yamaguchi2Shinozaki K,Carninci P , Hayashizaki Y, Shinozaki K1 Monitoring the expression pattern of 1 300 Arabidopsis genes under drought and cold stresses by using a full2length cDNA microarray1 Plant Cell , 2001 , 13 : 61 - 722 Ingram J , Bartels D1 The mol

30、ecular basis of dehydration tolerance in plants1 Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol ,1996 , 47 : 377 - 4033 Bray E A1 Plant responses to water deficit1 Trends Plant Sci , 1997 , 2 : 48 - 54 4 Pilon-Smits E , Ebskamp M, Paul M, Jeuken M, Weisbeek P , Smeekens S. Improved performance of transgenic

31、fructan- accumulating tobacco under drought stress. Plant Physiol , 1995 , 107 :125 - 130.5Yumaguchi-Shinozaki K,Koizumi M,Urao S.et al.Molecular cloning and characterization of nine cDNAs for genes that are responsive to desiccation in Arabidopsis thaliana:Sequence analysis of one cDNA clone tha encodes a putative transmerbrance channel protein .Plant Cell Physiol,1992,33;217-2246Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Characterization of the expression of a desiccation- responsive rd29 gene of the Arabidopsis thaliana and analy