生物还原剂SR4233对人脑胶质瘤细胞的细胞毒作用研究

1、生物还原剂SR4233对人脑胶质瘤细胞的细胞毒作用研究【摘要】目的研究药物SR4233对人脑胶质瘤细胞细胞毒作用及效应特点。方法采用成克隆分析法分析乏氧及空气条件下SR4233及顺铂单独用药和联合用药在不同药物浓度及作用时间下药物毒性及作用特点。结果SR4233对乏氧的脑肿瘤细胞具有特异毒性，乏氧细胞毒性比(HCR)值为47.1而作为阴性对照组的顺铂对乏氧细胞及有氧细胞的毒性作用相似，其HCR值为1.0。在乏氧条件下，SR4233和顺铂联合用药对乏氧细胞的杀灭作用大于单独用药，其中先给SR4233的效果优于先给顺铂，这可能是由于SR4233首先杀灭了大部分的乏氧细胞而顺铂则杀灭了剩余的乏氧程度

2、较轻的细胞，从而导致了给药顺序不同所致的效应差别。结论实验结果显示：SR4233是一种对乏氧细胞具有选择毒性的抗癌药，并对脑肿瘤的治疗具有一定应用潜力。【关键词】乏氧细胞;生物还原剂;胶质瘤脑肿瘤SR4233 Cytotoxicity of SR4233 to glioma cells YANG Weizhi*, John M.Brown. *Laboratory of Radiobiology,Department of Radiation Oncology,Cancer Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Me

3、dical College,Beijing 100021【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of SR4233(a new bioreductive anticancer drug) to U251 cells (glioma cells). MethodsClonogenic assay was used to determine the effect of SR4233 on U251 cells. On the day of experiment, cells were given different drug dose on spa

4、ced several times apart under hypoxic or aerated condition. ResultsThe results showed that SR4233 preferentially killed hypoxic cells,hypoxic cytotoxicity ratio (HCR) for SR4233 and cisplatin were 47.1 and 1.0 respectively under hypoxic condition. The cytotoxicity was stronger in combined SR4233 and

5、 cisplatin than SR4233 alone.The effect was better if SR4233 was given first than if cisplatin was given first. The reason of this sequential importance may have been that SR4233 killed most of the hypoxic cells and cisplatin annihilated the rest.ConclusionsThe results in our experiment suggest that

6、 SR4233 possess selective toxicity for hypoxic glioma cells. It is likely that SR4233 will be useful in the clinical practice of treating brain tumors.【Key words】Hypoxic cell;Bioreductive agent;GliomaBrain neoplasmsTirapazamine以往的研究表明，实体瘤内存在着一定比例的乏氧细胞(hypoxic cell)，这些乏氧细胞对电离辐射和化疗药都是耐受的，是造成治疗失败的重要原因之

7、一1。多年来肿瘤治疗学家和研究人员一直致力于寻找有效的乏氧细胞毒性药及有效的杀灭手段。SR4233(tirapazamine,TPZ)是美国斯坦福大学医学院放射治疗科与药厂合作研制的一种特异性杀伤实体瘤内乏氧细胞的新型抗癌药。作者研究SR4233对人脑胶质瘤U251细胞的毒性作用及效应特点。1材料与方法1.1细胞系及培养方法：人脑胶质瘤细胞系U251由斯坦福大学布朗实验室提供，用含有15%胎牛血清的Waymouths培养基培养，取指数生长期细胞进行实验。1.2药物及给药方法：药物SR42333-amino-l,2,4-benzotriazine1,4 dioxide,相对分子质量178，棕红色

8、粉末，易溶于水。给药方法：取指数生长期细胞接种于特别的玻璃平皿中，根据实验要求将SR4233用培养液配制成所需浓度，分别加入不同平皿中，并将平皿置于特制的密封装置Jig中然后在乏氧空气系统中分别进行细胞乏氧（给予95% N25% CO2，应确保氧的体积分数0.5)和空气对照各5分钟。1.3实验分组及观察指标：(1)SR4233对U251细胞的细胞毒性作用研究：实验分为乏氧组（Hypoxic）和空气组(Aerobic)，乏氧组包括0，25，50，75，100mol/L5个不同药物剂量点，空气组包括0，1，500，1000，2500,5000mol/L5个剂量点。加药后2个组细胞在乏氧空气系统中分

9、别进行乏氧或空气处理5分钟后，在37条件下作用1小时。(2)顺铂(cisplatin)对U251细胞毒性作用研究：为确定SR4233是否对乏氧的U251细胞具有特异毒性，作者选择顺铂作为阴性对照组。实验分为乏氧组（包括0，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0mol/L9个药物剂量点）和空气组（包括0，1，10，20，50mol/L5个药物剂量点）。加药后2个组细胞在乏氧空气系统中分别进行乏氧或空气处理5分钟后，在37条件下作用1小时。(3)SR4233，顺铂联合用药的时间效应关系研究：实验包括如下各点：空白对照（平皿内仅加入培养液）；单纯顺铂（5mol/L乏

10、氧条件下作用1小时）；单纯SR4233（40mol/L乏氧条件下作用1小时）；先5mol/L顺铂乏氧条件下作用1小时，用Hanks液洗去药液后加入SR4233 40mol/L，乏氧条件下作用1小时，2个药之间分别间隔0，1，2,3小时；先40mol/L SR4233乏氧条件下作用1小时，用Hanks液洗去药液后，加入顺铂5mol/L作用1小时，2个药之间分别间隔0，1，2，3小时。(4)观察指标及数据处理：上述各实验组按实验设计完成加药程序后，胰酶消化，计数细胞数，逐级稀释后将细胞接种在塑料平皿中，在37，5%CO2孵箱内开放培养14天，然后用结晶紫染色并进行克隆计数（计数50个细胞的集落），

11、并计算细胞存活率，最后用计算机进行统计学处理并拟合作。2结果1显示SR4233对U251细胞的细胞毒性作用，实验结果显示：SR4233对乏氧细胞的细胞毒作用明显大于有氧细胞，乏氧细胞毒性比(hypoxic cytotoxicity ratio,HCR)为47.1（HCR指达到相同细胞杀灭时空气条件下和乏氧条件下的药物浓度之比）。药物剂量(ol/L)1SR4233对乏氧及有氧U251细胞的细胞毒作用2显示顺铂对U251细胞的细胞毒性作用，实验结果显示顺铂对乏氧和有氧细胞的细胞毒作用相似，无明显区别，HCR值为1.0，表明顺铂对乏氧细胞不具特异毒性。药物剂量(ol/L)2顺铂对乏氧及有氧U251细

12、胞的细胞毒作用3显示SR4233和顺铂联合用药的时间效应关系，实验结果显示：(1)在乏氧条件下采用预实验得到的2个相等效应药物剂量,联合用药对乏氧细胞的杀灭作用大于各自单独用药，且随间隔时间的延长毒性作用有增大趋势；(2)SR4233+顺铂和顺铂+SR4233有较明显的效应差别，其中先给SR4233的效果优于先给顺铂，这可能是由于在乏氧条件下，先给SR4233杀灭了大部分乏氧细胞而后的顺铂则杀灭了剩余的乏氧程度较轻的细胞，从而导致了给药顺序不同所致的效应差别。间隔时间（小时）3SR4233，顺铂单独和联合用药的时间效应关系3讨论以往的研究表明，在实体瘤中存在着一些乏氧细胞。对放射治疗、化疗而言

13、，实体瘤中的这些乏氧细胞是一个潜在问题，因为乏氧细胞对许多治疗手段都是耐受的，被认为是导致治疗失败的重要原因。目前有许多方法被用来尝试克服乏氧细胞的这种治疗耐受性，包括氧气的使用（用来改进肿瘤的氧合状态）、化学药物以及生物还原剂（选择性杀灭肿瘤细胞内的乏氧细胞）等。生物还原剂指在乏氧条件下能被还原的一类药物，通常产生一个比原先化合物更活跃的代谢物。SR4233作为一种对乏氧细胞有特异毒性的生物还原剂已进行了较为深入的研究，它的作用机制是在乏氧条件下药物代谢产生自由基，这些自由基可氧化生物大分子从而形成相似于高LET引起的染色体DNA断裂1-3。Zeman等2提供了仓鼠、小鼠和人不同细胞系的材料

14、，发现SR4233对所有细胞系都有不同程度的乏氧细胞毒性，乏氧细胞毒性比(HCR)大致为25200。此后不同作者陆续发表了有关SR4233的研究文章，结果大致相同，HCR值在50200之间，大大高于丝裂霉素（HCR值仅为115）和2-哨基咪唑（HCR值为515）4-6。那么HCR究竟多大合适？大致有两种意见：一种认为是10或更大一点合适，另一种认为HCR值越大越好。由于对空气细胞（aerobic cells）的毒性更相似于对机体产生的系统毒性，因此应保持在最小。基于上述原因，对一个药物的设计HCR值至少应是10，且越大越好。至今在临床或即将临床应用的生物还原剂中只有SR4233和RSU1069

15、符合这个要求。目前SR4233已进入期临床实验，用于头颈肿瘤的放射治疗，所用剂量为159mg/m2,每周3次，共4周3。虽然设计SR4233的初衷是针对分次放射治疗中存在的乏氧细胞的辐射耐受问题，但大量的实验证明该药除了具有乏氧细胞增敏剂作用外，与某些化疗药联合应用对化疗也有增效作用，这方面的研究目前还在进行中。尽管对SR4233的乏氧细胞毒性进行了不少研究，但其对脑肿瘤作用如何还不甚清楚，作者采用人胶质瘤细胞系U251细胞进行了这方面的研究。研究结果显示：SR4233对乏氧的U251细胞有非常显著的细胞毒性（HCR值为47.1），与顺铂联合用药对乏氧细胞的毒性大于单独用药；且表明SR4233

16、对乏氧的脑肿瘤细胞也具有明显的特异毒性。以上提示SR4233是一种具有良好乏氧细胞毒性的抗癌药，它的研制成功不仅为克服肿瘤内乏氧细胞的治疗耐受问题提供了有效治疗手段同时也为脑肿瘤的治疗提供了新的途径。作者单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放射治疗科放射生物室(杨伟志)；Department of Radiation Oncology,School of Medicine,Stanford University,USA(John M. Brown)参考文献1Brown JM. Tumor hypoxic: problems and opportunities. En

17、cyclopedia Cancer,1997,10(1):1-15.2Zeman EM, Brown JM, Lemmon MJ. SR4233: a new bioreductive agent with high selective toxicity for hypoxic mammalian cells. Int J Radiat Oncol Biol Phys,1986,12(7):1239-1242.3Brown JM,Wang LH.Tirapazamine:laboratory data relevant to clinical activity.Ant Cancer Drug Design,1998,13(3):529-539.4Brown JM. SR4233(Tirapazamine): a new anticancer drug explosion hypoxic in solid tumors. Br J Cancer,1