癌相关蛋白bcl-2和P53在膀胱上皮异生和移行细胞癌的逆反性表达

1、    癌相关蛋白bcl-2和P53在膀胱上皮异生和 移行细胞癌的逆反性表达        摘要应用免疫组化ABC法研究了54例膀胱移行细胞癌(TCC)全切标本中bcl-2和P53在正常、异生上皮和癌组织中的表达。结果显示：bcl-2表达在正常和轻度异生上皮仅限于基底层，在中度和重度异生则可见于中上层，27例癌标本bcl-2阳性,并与癌分级显著相关;随着异生恶性度的增加,P53阳性病例也逐渐增多(P<0.01),38例癌组织P53呈阳性,并与肿瘤分期分级和生存

2、率明显相关;低分级或浅表型肿瘤的“bcl-2丢失”现象明显增多,“P53逞现”现象则在高分级或浸润型肿瘤更显著;双抗体免疫组化显示,bcl-2和P53通常表达于不同的异生或癌细胞;癌组织中bcl-2和P53均阴性的患者其生存率显著高于两者均阳性者(P<0.05)。结果提示bcl-2在TCC的发生发展过程中可能起重要作用。关键词膀胱肿瘤癌基因Reciprocal expression of bcl-2 and P53 oncoproteins in dysplasia and transitional cell carcinoma of the urinary bladderLi Beny

3、i*,Zhang Yongshang, et al. *Department of Urology,the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001Abstractbcl-2 and P53 expressions were studies by means of immunohistochemically method in the normal urothelium, the dysplastic and cancer tissues of 54 cases of bladder transitio

4、nal cell carcinoma.In the normal and mild dysplastic urothelium, bcl-2 was found to be restricted to the basal cell compartment while in the moderate and severe dysplastic urothelium it could also be detected in the upper compartments.bcl-2 expression was detected in 27 cancer tissues and was relate

5、d to the tumor grade (P0.05).The P53 positive rate increased with the advancement of the dysplasia (P0.01) and was significantly correlated with the tumor grade and stage and the survival of the patient (P0.05).The phenominum of “bcl-2 loss” was more commonly seen in the superficial or low grade can

6、cer than in the invasive or high grade cancer (P0.05).On the other hand P53 expression was more frequently found in the invasive and high grade cancer (P0.02).When both bcl-2 and P53 were negative the prognosis of the patient was signifily better than those with both bcl-2 and P53 positive (P0.05).I

7、t was suggested that bcl-2 occurred earlier than P53 in the early stage of dysplasia and might play an important role in the pathogenesis of transition cell carcinoma of bladder.Key wordsBladder neoplasmsCarcinomaGenes膀胱移行细胞癌(TCC)是泌尿系统最常见的肿瘤，其主要特征是多中心性和易复发性，在肿瘤周围或远隔部位常伴有不同程度的上皮异生性病变，已有资料证实是否伴随上皮异生，与

8、肿瘤复发和进展有明显关系1。为了研究在膀胱TCC发生发展过程中原癌基因bcl-2是否或何时出现异常表达，及其与抑癌基因P53表达的关系，我们应用免疫组织化学方法，研究了54例非转移性TCC患者的膀胱正常上皮、异生病变和癌组织中bcl-2和P53的表达特征,及其与患者生存率的关系。 材料和方法一、病例资料112例非转移性TCC膀胱全切标本中,经逐步切片1和HE染色后筛选伴有各种程度上皮异生的54例作为研究对象,其中男43例,女11例,平均年龄69.7岁(5391岁)。中位随访时间37个月(3106个月)。依照WHO和UICC分级分类方法,TCC病变中表浅型(Ta和T1)和浸润型(T3和T4)各2

9、7例,低分级(G1和G2)22例,高分级(G3)32例。上皮异生病变依文献报道方法2分为轻、中和重度三类。二、免疫组织化学染色bcl-2抗体（克隆bcl-2/124，丹麦Dako公司产品）和P53抗体(克隆DO-1,美国癌基因科学公司产品)均为鼠单克隆抗体。免疫组织化学染色采用标准ABC方法,组织切片厚度4m。染色各步骤之间用磷酸盐缓冲液（PBS,pH7.6）漂洗。切片经二氨基联苯胺（DAB）显色和苏木素轻染后脱水封入。阴性对照切片用PBS替代第一抗体，其他步骤相同。同一切片bcl-2和P53双重染色的步骤与上述相同,先进行抗bcl-2染色,DAB显色及水洗后,将切片置于甘氨酸缓冲液(pH2.

10、2)室温下漂洗60分钟,以去除残留抗原抗体复合物,然后进行抗P53染色,用氯化钴-DAB混合液显色，将阳性部位染成蓝黑色，最后脱水封入。三、染色结果计测和统计方法免疫组织化学染色结果分析采用半定量方法。bcl-2染色结果以切片内淋巴细胞的阳性强度(通常为强阳性)为对照分别计测为阴性(-)、阳性(+)和强阳性(+)。P53染色结果依切片内阳性肿瘤细胞的百分数分为:<10%为(-),10%为(+),30%50%为(+),>50%为(+)。正常上皮、各种程度异生病变和癌组织之间bcl-2和P53染色结果的比较采用卡方检验,并计算它们与肿瘤分级和分期之间的相关系数。生存率分析采用Kapla

11、n-Meier方法,并进行Log-rank检验。结果一、bcl-2和P53蛋白表达在正常和轻度异生上皮，仅基底层细胞有较弱的bcl-2蛋白表达。随着上皮异生程度的加重，bcl-2在异生上皮的中上层部位的表达逐渐增加。27例癌组织标本呈bcl-2阳性,而且与癌细胞分级有显著相关性(P<0.05),但与病理分期无关。随着上皮异生程度的加重，P53阳性病例逐渐增多，38例(70%)癌组织标本P53阳性，并与病理分期（r=0.336,P<0.05）和癌细胞分级(r=0.408,P<0.02)有显著相关性。二、bcl-2和P53蛋白表达的逆反性关系bcl-2和P53的表达在大多数病例的

12、异生或癌组织标本中均存在明显的逆反性关系（表1）;“bcl-2丢失”现象（异生性病变呈阳性而癌组织呈阴性）以及“P53逞现”特征(异生性病变呈阴性而癌组织呈阳性)在分化较好或浅表型肿瘤和分化不良或肌层浸润型肿瘤的差异见表2。bcl-2和P53双抗体免疫组化染色结果显示，即使在两者同为阳性的标本，它们也很少表达于同一细胞内，在重度异生和原位癌，bcl-2和P53的异生细胞或癌细胞占50%以上者，重度异生标本3例,癌组织仅2例。三、bcl-2和P53蛋白表达与生存率的关系癌组织中P53蛋白的表达特征与患者的生存率显著相关(P<0.05),尽管bcl-2表达与生存率无关,但与P53联合分析后显

13、示,bcl-2和P53均阴性的患者其生存率显著高于两者表1bcl-2和P53在异生病变和癌组织的表达()bcl-2(+)/P53(+)bcl-2(+)/P53(-)bcl-2(-)/P53(+)bcl-2(-)/P53(-)轻度异生9(16.7)43(79.6)*0( 0 )2( 3.7)中度异生14(25.9)31(57.4)*5( 9.3)4( 7.4)重度异生19(35.2)23(42.6)#10(18.5)2( 3.7)癌 组 织19(35.2)8(14.8)19(35.2)#8(14.8)     注：bcl-2(+)包括+和+; P53(+)

14、包括+、+和+。 * P<0.01， #P<0.05 表2bcl-2丢失和P53逞现与病理分期和肿瘤分级的关系()例数bcl-2丢失P53逞现浅表型2718(66.7)7(25.9)浸润型278(29.6)17(60.9)P值<0.02<0.02低分级2215(68.2)5(22.7)高分级3211(34.4)19(59.4)P值<0.05 <0.02     均阳性者(P<0.05)。 讨论肿瘤形成是多种基因异常事件参与的复杂过程，如癌基因的突变、扩增或重排以及抑癌基因失活等。近年的研究资料已证实bcl-2基因

15、异常表达可能是大多数肿瘤形成的重要因素之一，不过其异常表达的确切机制还不清楚。最近的研究表明，bcl-2和P53参与肿瘤形成的作用机理与细胞凋亡的控制有关，但两者间的确切关系还未完全明了。已知bcl-2可抑制野生型P53诱导的细胞凋亡3， 而P53基因产物则下调bcl-2基因的表达4,并已发现大多数人类癌组织和癌前病变中有bcl-2和P53蛋白的异常表达,包括膀胱癌5。在大肠、子宫颈和胃癌组织或异生上皮中,bcl-2的表达与异生和癌细胞的恶性度明显相关,并与P53表达呈逆反性关系68,目前有关bcl-2表达在膀胱肿瘤的发生发展过程中的演变及其与P53表达的关系尚未见报告。本研究结果显示，正常和

16、轻度异生的膀胱上皮只在基底部分有bcl-2表达，与其他上皮组织的表达特征相似68,表明该蛋白通过维持干细胞的增殖能力,在保持组织结构相对稳定上起一定的作用。随着异生上皮的恶性度增加，bcl-2在中上层部位的表达逐渐增加，虽然重度异生和癌组织的bcl-2阳性率减少，但是P53阳性病例显著增加,而且“bcl-2丢失”现象主要表现在浅表型或低分级肿瘤,“P53逞现”特征则在肌层浸润或分化不良的肿瘤表现得更突出;另外,绝大多数异生或癌组织标本的bcl-2和P53呈逆反性表达,即使在两者同为阳性的标本,它们也很少表达于同一细胞内,bcl-2和P53的这种逆反性表达可能与异常表达的P53蛋白下调bcl-2

17、有关9。上述结果提示，在膀胱TCC的发生发展过程的早期,异常表达的bcl-2蛋白通过抑制细胞凋亡,使带有异常遗传物质的细胞持续增殖,在异生上皮向癌性上皮演变的过程中可能起重要作用,此后,随着P53出现异常,在分化不良的肿瘤两者共同促进其浸润和进展,而在分化较好的部分肿瘤bcl-2蛋白则出现丢失。至于bcl-2表达与疾病预后的相关性因肿瘤类型不同而存在不同观点,有资料显示大多数恶性肿瘤包括上尿路TCC中bcl-2表达可作为独立的预后因子10，但是在浸润性膀胱癌则与预后无关5。本研究表明，尽管bcl-2表达与患者生存率无关，但与P53联合分析后显示,bcl-2和P53均阴性的患者生存率显著高于两者

18、均阳性的患者,在bcl-2阳性而P53阴性的患者与bcl-2阴性而P53阳性的患者之间无差异,表明bcl-2的表达在一定程度上影响患者生存率。总之，本研究结果提示bcl-2的异常表达早于P53出现于上皮异生的早期阶段,两者在上皮异生和癌组织中呈逆反性表达,共同参与TCC的发生发展过程,并在一定程度上影响患者生存率。参考文献1Kakioe T,Matumoto K, Nishio Y ,et al.Significance of carcinoma in situ and dysplasia in association with bladder cancer.J Urol,1985,133:3

19、95-398.2Murphy WM,Soloway MS. Urothelial dysplasia.J Urol,1982, 127:849-853.3Wang Y,Sxekely L,Okan I,et al. Wild-type P53-triggered apoptosis is inhibited by bcl-2 in a v-myc-induced T-cell lymphoma line. Oncogene,1993,8:3427-3431.4Miyashita T,Krajewski S,Krajewski M.Tumor suppressor P53 is a regula

20、tor of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo.Oncogene, 1994,9:1799-1802.5Glick ST,Howell LP, Danvere White RW. Relationship of P53 and bcl-2 to prognosis in muscle-invasive transitional cell carcinoma of the bladder. J Urol,1996,155:1754-1757.6Kaklamanis L,Savage A,Mortensen N,et al.Early expression of bcl-2 protein in the adbenoma-carcinoma sequence of colorectal neoplasia.J Pathol,1996,179:10-14.7Hamsel BT,Smedts F,Kuijipers J,et al.bcl-2 immunoreactivity increases with