海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究_图文

1、中国海洋大学博士学位论文海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究 姓名:吕志华申请学位级别:博士专业:水产品加工与贮藏工程指导教师:刘昌孝20080601海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究 摘要海洋硫酸多糖PS916是以来源于海洋的甲壳质为基础原料,经多步分子修饰 而得到的一种硫酸氨基多糖,化学名为13-(1,4一3.氧.硫酸基一6一氧一硫酸基一6一氧一羧 甲基醚钠盐,英文名为p一(1,4polyglycosamine一3-O-sulfate6O sulfate一6一Ocarboxylmethyl ethersodiu

2、m,药效学研究结果表明PS916具有调血脂、抗脂质过 氧化、抑制血管平滑肌细胞增殖等作用,具有多途径抗动脉粥样硬化作用,系正 在进行系统研究的I类新药。本文对PS916在大鼠体内的药代动力学、组织分布 及排泄进行了研究,初步阐明了PS916在大鼠体内的吸收,分布及排泄过程,为 新药开发和临床用药提供了一定的理论依据。本论文主要研究工作如下:一、PS916的荧光标记研究PS916为多糖类物质,在分子结构中缺乏发色团和荧光团,不能直接用紫外 或荧光法进行检测,质谱法也不适合多糖的定量分析。因此,我们以异硫氰酸荧 光素(FITC为荧光标记试剂,对PS916进行了荧光标记,标记后的PS916的荧光 最

3、大激发波长EX为480nm,最大发射波长Em为515nm;荧光标记的PS916中含 FITC 0.74%;以高效凝胶色谱法测定PS916分子量及分子量分布,测定结果表 明,标记后的PS916平均分子量及分子量分布宽度与标记前比较均未发生显著变 化。二、PS916的体内外稳定性研究以荧光标记的PS916为研究对象,采用高效凝胶色谱法考察PS916在磷酸 盐缓冲液(PBS及大鼠血浆中的稳定性。PS916体外在PBS、大鼠血浆及大鼠 尿液中37"C孵育lh、2011,其分子量及分子量分布宽度均未发生变化,荧光强度 也未发生变化,表明PS916体外在PBS、大鼠血浆及大鼠尿液中稳定。同时,

4、对大鼠以口服和静脉注射两种给药方式给药后PS916在血浆、尿液和粪便中的稳 定性进行了研究,体内大鼠口服PS916后血浆和粪便中PS916均以原型形式存在; PS916静脉注射给药后尿液中以原型形式从尿液中排泄,说明大鼠口服和静脉注海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究射PS916后,主要以原型的形式吸收代谢。三、PS916在生物样品中的定量分析方法研究建立了生物样品中PS916的荧光定量分析方法,PS916的血浆浓度在O.220 pg/mL的浓度范围内PS916的荧光强度与浓度具有良好的线性关系,线性方程为: Y=22.951x一3.3561,相关系数r2=o.9991,血浆中P

5、S916最低定量限为0.2pg/mL; 低、中、高(0.2、2.0、20.O“g/mL3种浓度的日内精密度在1.527.83%之 间,日间精密度在2.148.42%之间,组内回收率在84.3108.O%之间,组间回 收率在88.7-100.1%之间;血浆样品稳定性考察显示PS916在-70。C条件下放置4周相对稳定。PS916在组织、尿液及粪便中的线性、精密度、准确度及稳定性分 析均符合生物样品体内定量分析的要求。证明本实验方法适用于PS916在大鼠血 浆、组织等生物样品中含量的测定。四、PS916在大鼠体内的药代动力学研究1、大鼠口服和静脉给药PS916后,血药浓度一时间曲线数据采用非房室模

6、 型计算药代动力学参数,通过饧缎和AI_/C与给药剂量的相关性分析结果表明, 大鼠口服和静脉给药后,PS916在大鼠体内呈线性动力学特征。2、大鼠口服PS916后,三种剂量的平均Tmax为3.28士0.58h,可知PS916在大鼠体内吸收较慢,达峰迟缓。大鼠口服三种剂量下平均消除半衰期0/2为7.84 4-0.12h,大鼠静脉注射三种剂量下平均消除半衰期锄为8.744-1.Olh,口服和静 脉给药后的fJ尼无统计学差异(P>O.05,PS916在大鼠体内的半衰期较长, 3、大鼠口服和静脉给药后,用么计算PS916绝对生物利用度为9.06%,显示大鼠口服PS916吸收较差,生物利用度较低。

7、4、在大鼠连续给药实验中,口服50mg/kg剂量PS916多次给药与单次给药 相比,药.时曲线基本吻合,首、末次给药后的f,力和么值均无统计学差异,提示PS916多次给药体内不易蓄积,且对其代谢酶无诱导抑制作用。5、大鼠单次口服PS916后,组织分布实验表明,给药后1h,药物能分布到 大部分组织中,在肠和胃中分布最高,另外主要分布在血流充足的肝和肺组织; 给药6h后,肠和胃组织中药物浓度明显下降,肾脏中药物浓度明显升高,表明 PS916吸收入血后的药物主要经肾脏随尿液排出:给药24h后,大部分组织中药 2物浓度均明显降低。给药后脑组织中可检测到药物,说明PS916能透过血脑屏障, 向脑内分布。

8、6、大鼠单次静脉给予PS916后,组织分布实验表明,PS916静脉给药后在 大鼠各主要组织中广泛分布。给药后lh,PS916在大鼠肾脏、肝脏、血浆中的浓 度较高,在肾脏中浓度最高,在肠中亦有相对较高浓度,在肾脏中含量高说明该 药物主要经肾排泄。PS916静脉注射6h后,肾脏中药物浓度在3个时间点中最 高,在肾脏、肝脏、肠、心、肺、胃、脾等组织中的浓度均大于其血浆浓度,说 明、PS916的组织分布比例较大。给药后PS916在脑中亦可检出,说明PS916能 透过血脑屏障,向脑内分布。7、大鼠口服给予PS916后,主要以原型从粪便和尿液中排出体外,给药72h 后,尿中PS916的累积排泄量占给药剂量

9、百分比为1.2884-0.958%;粪中PS916的累积排泄量占给药剂量百分比为78.9744-5.498%;灌胃给药后72h内,有相当 于给药量80.26%的药物以原型的形式随尿粪排出体外,灌胃给药后PS916主要 是从粪便中排出。8、大鼠静脉注射给予PS916后,主要以原型从粪便和尿液中排出体外,给 药72h后,尿中PS916的累积排泄量占剂量百分比为54.388士11.832%;粪中PS916的累积排泄量占剂量百分比为6.2864-1.938%;静脉注射给药后72h内,有相当 于给药量60.67%的药物以原型的形式随尿粪排出体外,静脉给药后PS916主要 是从尿液中排出体外。关键词:海洋

10、多糖药物PS916;荧光标记;药代动力学STUD I ES 0N FLUORESCENT LABEL I NG AND PHARMACOK I NET l CS 0F MAR I NE SULFATED POLYSACCHAR I DE PS916AbstractPS916is a new form of sulfated amino polysaccharide that is derived from marine chitin and by ways of molecular modifications.It is characterized by 1,4-1inked pD-gluco

11、samine vvitll an average of 1.0sulfate and 0.5carboxylmethyl groups per unit monosaccharide.The average molecular weight of PS916is 7000Da and the distribution width of molecular weight is less than 1.5.Systematic pharrnacodynamic research shows that PS916has good antiatherosclerotic activity and Wa

12、s authorized to enter clinical trial in China.T11is paper was designed to evaluate the pharmacokinetics features of PS916in rats to provid scientific data for the new drug development and clinic use.1.The fluroeescent labeling of PS916PS916,similar to other polysaccharides such as glucosan,possesses

13、 few chromophoric or fluorophoric structurally,SO derect detection is impossible、i廿l violet-visible(uvVisor flurocescence method,Mass spectra method is unsuitable to quantification analysis of polysaccharides either.Fluoresceinisothiocyanate(FITC is a fluroscent labeling regent usually used to label

14、 protein,SO we chose it to label PS916because just like protein there is amino group in its structure.UVVis and flurocescence spectroscopy demonstrated the labeling of FITC to PS916.The maxium excition wavelength of labeled PS916is 480nm,and the maxium emission wavelength is 515nm.Furthermore,labele

15、d PS916was determined spectrophotometrically by visible absorption at 490nm with reference to FITC,the content of FITC in labeled PS916was 0.71%(w/w.The molecular weight of labeled PS916WaS examined by hi曲performance gel permeation chromatography(HPGPC. The average molecular weight and the distribut

16、ion width of molecular weight of 5海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究labeled PS916were not signifficent different from that of unlabeled PS916.2.The stability of PS916in vitro and in vivoThe stability of PS916in vitro and in vivo was investigated using HPGPC method 谢t11fluorescesent labeled PS916.After l,20h

17、incubation inphosphate buffer,rat plasma and rat urine at 37。C,the molecular weight and the width of molecular weight distribution were not changed,that showed PS916Was stable in vitro.After oral administration of PS916to rats,PS916was in its original form in rat plasma and rat feces,meanwhile after

18、 all intravenous administration of PS916to rats,PS916Was also excreted in its original form in rat urine,that demonstrated PS916metabolized in its original form.3.The establishment of analyileal method of PS916in biological matrixA rapid,sensitive fluroescence method Was developed to determine PS916

19、in biological matrix.11le linear calibration curve was obtained in the range of 0.2-20 rtg/mL in rat plasma.The lower limit of quantitation(LLOQwas 0.21xg/mL.The inter-day CV%at 0.2,2.0and 20I.tg/mL of PS916Was 6.35%,3.81%and 1.68%, respecttively.The intra-day CV%at the above concentrations Was 8.42

20、%,4.38%and 2.14%,respectively.Oneway analysis of variance(ANOVAWas carried out witll grouping variable“day”to assess precision at 95%level.The result Was non-significant when data for each day was compared with other days and within the same day.The calibration curves were also linear in other biolo

21、gical sample such as tiusse,urine and feces,range winl correlation coefficient all above O.99.The established method is suitable for PS916pharmacokinetics studies.4.The pharmaeokinetics study of PS916Individual plasma-concentration data were analyzed by noncompartmental in this paperAfter intravenou

22、s and oral administration of PS916to rats,the proportionality between dosage and G懈or A UC was calculated,A good correlation Was found 6. 海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究between the dosage and AUc and C懈,PS916exhibited doseproportionalpharmacokinetics、vith linear kinetic character.Following oral administra

23、tion,theaverageof three dosages was 3.284-0.58h, that means the absorption of PS916was slowly.After intravenous and oraladministration,the averagetv2were 7.844-O.12h and 8.744-1.01h,respectively, PS916had a long terminal half-life.The absolute oral bioavailability of PS916was 9.06%,which was calcula

24、ted by compared the Aof oral administration to the Aof intravenous administration at the dose of 25mg/kg.The bioavailability of PS916was low.After multiple dosage of PS916at 50mg/kg,the plasma concentration-time profile was basically the same as that of signal dosage,t/n and A UCwere nonsignificant

25、between thefirst and the last dosage,that mean PS916Was not accumulated in rats. PS916Was widely distributed to tissues of most organs in rats lh after oral administration of PS916,such as stomach,intestine,liver,kidneys,lung and heart. The concentration in stomach and intestine was the most highest

26、 in all tissues,the concentration in lung and liver Was higher than other tissues.The concentration in stomach and intestine degraded rapidly,and increased rapidly in kidney 6h after oral administration of PS916,that show PS916Was excreted mainly by kidney after absorption.For all tissues,PS916conce

27、ntrations had significantly decreased at the time point of 24h after oral administration.PS916was also be detected in brain,that mean PS916COuld also across blood.brain barrierPS916was widely distributed to tissues of most organs in rats lh afterintravenous administration of PS916,suchas liver,kidne

28、ys,lung,heart and intestine.The concentration in kidney,liver and plasma Was higher,the most highest in kidney,that show PS916Was excreted mainly by kidney.The concentration in most tissues such as liver,kidney,lung,heart,spleen and intestine Was higher than that of plasma,that meanPS916Was widely d

29、istributed tO tissues.PS916was also be detected in brain, that mean PS916could also across blood.brain barrier. 7海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究PS916was mainly excreted in its original form from feces and urine after oral administration.Cumulative amounts percentage of PS916in feces at 72h after all oral

30、dose was 78.9744-5.498%.Cumulative amounts percentage of PS916in urine at 72h after an oral dose was 1.2884-0.958%.Drug which Was excreted totally in urine and feces in 72h after an oral administration of PS916was equal to 80.26%of given dose. PS916Was mainly excreted from feces after oral administr

31、ation.PS916Was mainly excreted in its original form from feces and urine after oral administration.Cumulative amounts percentage of PS916in urine at 72h after an oraldose Was 54.388士1 1.832%.Cumulative amountspercentage of PS916in feces at 72h after an oral dose Was 6.2864-1.938%.Drug which Was excr

32、eted totally in aline and feces in 72h after an oral administration of PS916WaS equal to 60.67%of given dose.PS916was mainly excreted from urine after oral administration.Key Words:marine sulfated polysaccharide PS916;fluroceseent labeling; pharmacokinetics8独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

33、据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果,也不包含未获得 (蕉!麴逡直基丝壶要挂别童塑 的!奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名:乏乏牢 签字日期:砒年6月/歹日 学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论

34、文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书学位论文作者躲 乏乏。年 导师签字:坳 签字日期:矽谗年c7月K日 签字日期:矽髫年6月7s日学位论文作者毕业后去向:工作单位:通讯地址: 电话:邮编海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究0前言糖类是在自然界中动物、植物和微生物体内广泛存在的一类物质,与蛋白质 和核酸共同构成生命三大物质。糖的准确的化学定义为多羟基醛或酮,早期发现 的糖类化合物它们的分子式可以用通式(CH20n表示,因此糖又称碳水化合物, 随着研究的不断深入,发现一些化合物的结构和糖类很相似,但分子中还具有氮、 硫等其它原子,仅用C、H、0-种元素和(CH20n的通式已不能完

35、全代表这一 类化合物,碳水化合物的概念已不断扩大。糖分子中含有多个羟基,糖与糖之间 可通过糖苷键连接,进而又可将糖分为单糖、寡糖(2.10和多糖(>10。人们 对糖的早期认识只限于它可以作为能源物质及细胞和组织的支撑结构成分,1900年K.Landsteiner发现人的ABO血型系统,经过半个多世纪的研究,1960年W.M. Watkins确定了ABO抗原的决定基的糖链结构,发现A型和B型抗原仅有一个糖基 的差别【l】。1930年A.Fleming发现了青霉素,而青霉素的作用机制是抑制细菌肽聚 糖合成【21。50年代发现流感病毒入侵肌体亦与一种叫做唾液酸的糖分子有关13。 80年代末成功

36、克隆了糖基转移酶,这在阐明体内糖链合成机理过程中发挥了巨大 作用,使人们对糖链的复杂性和代谢过程有了更深的认识,对糖的生物功能有了 新的认识【4】。人们发现糖不仅广泛参与了细胞各种生命现象的调节,同时还参与 细胞的转化、分裂、再生等生理过程,糖与蛋白质、脂类形成的糖蛋白、脂多糖 在细胞的识别、分泌以及在蛋白质的加工和转移方面起着不容忽视的作用,由此 逐渐发展形成了糖生物学【5】。糖生物学研究的一场革命发生在1990年,3个不同 的研究小组几乎同时发现血管内皮细胞一白细胞黏附分子(E.selectin,这种分 子能识别白细胞表面的四聚糖唾液酸路易斯X(Slex,这是第一次在人体中确 证了糖结合蛋

37、白与寡糖之间的识别功能,由此将糖生物学推向生命科学的前沿 【l】。糖类药物的研究也在此背景下逐步发展。O.1糖类药物研究0.1.1糖类生物活性研究概况随着糖化学与糖生物学的不断发展,人们认识到糖类及其复合物具有重要的 生物功能,表现出多种生物活性,如免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究射、抗凝血、降血糖、降血脂等。0.1.1.1多糖的免疫调节作用目前普遍认为,多糖是一种无细胞毒的免疫促进剂,多糖的大多数生物活性 和功能均与免疫系统有关。多糖主要通过以下途径发挥其免疫促进作用:1提高巨噬细胞(M西的吞噬能力,诱导白细胞介素I(1L.1和肿瘤坏死

38、 因子(TNF的生成。具有这种免疫增强功能的多糖主要有香菇多糖、牛膝多糖、 枸杞多糖、裂褶菌多糖、人参多糖、树舌多糖、海藻多糖等。正常小鼠给予枸杞 多糖(LBP40mg/kg/d X 7d,ip,能增强经刀豆素(Con A处理的MO对肿瘤靶细胞 增殖的抑制活性16】。从商陆块根分离出来的酸性杂多糖PFP.I,能使ICR小鼠 腹腔MtI对￥180和L929肿瘤细胞产生明显的细胞毒作用,促进细胞脂多糖 (LPS对IL一1和TNF诱生,其诱生IL一1的能力比卡介苗(BCG强,提示 PFP.I增强MO细胞毒的作用与其诱生IL.1和TNF密切相关171。人参多糖能直接 激活人的单核细胞,并分泌出白细胞介

39、素.8(IL.8。IL.8是一种较强的趋化因子, 能趋化并激活中性粒细胞,促进其溶酶体酶活性和吞噬作用,对嗜碱性粒细胞和 T细胞也有一定的趋化作用。此时IL.1也会随着几.8含量的升高而增加瞄J。 2促进T细胞增殖,诱导其分泌白细胞介素2(IL.2。具有这种免疫增强功 能的多糖主要有:中华猕猴桃多糖、猪苓多糖、刺五加多糖、人参多糖、灵芝多 糖、黄芪多糖、枸杞多糖等。以BALB/C小鼠为研究对象,分组灌服枸杞多糖、 环磷酰胺、环磷酰胺加枸杞多糖,测定总T淋巴细胞、TB、TH、TH/TB的数 量及淋巴细胞转化率。结果表明枸杞多糖能增加总T细胞及TH亚群百分含 量,提高淋巴细胞转化率,对环磷酰胺所诱

40、发的免疫功能低下反应,枸杞多糖还 有回复作用,使降低的总T细胞,TH、TH/TB及淋转率回复到正常或接近正 常对照水平91。Funoran从Gloiopeltistenax中提取的一种海藻多糖可诱导荷瘤小 鼠SRBC的迟发性超敏反应,增强脾淋巴细胞到浆细胞的转化,增强外周血中 L3T4+和Lyt2+T细胞的百分率,增强辅助性T细胞、杀伤性T细胞、自然杀伤细 胞的活性1101。香菇多糖能明显促进淋巴细胞激活因子(LAF的产生,促进几.2产 生,促进多种未成熟的前T细胞成熟及向成熟T细胞分化,微量的香菇多糖 可使小鼠胸腺细胞对IL.2的反应性提高。香菇多糖是典型的T细胞激活剂, 它在体内和体外均能

41、促进特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL的产生,并提高CTL 2海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究的杀伤活性111】。灵芝多糖可通过间接激活淋巴细胞中DNA多聚酶,而促进 DNA合成及T细胞增殖,促进IL.2产生,从而影响T细胞亚群的数量和功 能【121。3促进淋巴因子激活的自然杀伤细胞呷<的活性。这类多糖有枸杞多糖、 刺五加多糖、黄芪多糖、鼠伤寒菌内毒素多糖等。自然杀伤细胞(NK是生物体内 天然存在的非特异的免疫杀伤细胞,它在宿主的免疫监视功能中有着重要的作 用。牛膝多糖60mg/kg/d腹腔注射lOd不仅能对抗环磷酞胺(CY所致的小鼠外 周血中NKC活性降低,还能提高正常小

42、鼠外周血中NKC活性【l引。人参多糖 能够提高荷瘤小鼠的NKC活性,诱生肿瘤坏死因子(TNF,通过内源性生成的 多种细胞因子激活NKC与T淋巴细胞,对肿瘤细胞株起不同程度的杀伤和抑 制作用【14J。从多叶奇果菌(Grifolafrondosa分离得到的多糖D.片段,能激活肿 瘤患者体内的NK细胞,使TNF一0【和Y干扰素(玳F.Y水平升高,同时还可以 通过激活巨噬细胞使IL-2分泌增加,后者也是NK细胞的激活剂,使NK细胞长期发 挥细胞毒作用,抑制肿瘤细胞的生长【15】。当归多糖能增强白介素.2(IL.2、白 介素-4(IL.4、白介素一6(IL.6和INF.Y的表达,其过程是首先激活涉及非特

43、异 性免疫作用的巨噬细胞和NK,然后是T辅助细胞,增加抗体数量,进而协同 增强免疫功能116J。螺旋藻多糖(SPP毒性试验表明,作为生物反应调节剂将其用 于白血病细胞治疗可提高NK活性【17】。4提高B细胞活性,增加多种抗体的分泌,加强肌体的体液免疫功能。 这类多糖有:银耳多糖、香菇多糖、苜蓿多糖、海藻多糖等。口服紫云英多糖能 提高老年鼠体液中IgM的数量【18】。用热水提取的可食性褐藻多糖能诱导小鼠脾 细胞增殖,B细胞及其所分泌的抗体IgM和IgG的数量增加;是小鼠B细胞 的有丝分裂原,具有多克隆激活B细胞增殖作用,而对T细胞没有诱导增殖 作用1191。当归多糖在体内外均能使多克隆流性的小鼠

44、B淋巴细胞活化,对当归 多糖应答的B细胞可分化到不同成熟阶段,部分细胞群成熟为抗体分泌细胞 【201。牛膝多糖能明显提高正常小鼠血清总IgG及特异性溶血素水平,增加脾脏 PFC数目,对抗环抱霉素A引起的PFC及IgG水平的下降,增强小鼠单核巨 噬细胞的吞噬功能【211。5通过不同途径激活补体系统,有些多糖是通过替代通路激活补体,有些海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究则通过经典途径起作用。这类多糖有:酵母多糖、当归多糖、茯苓多糖、车前子 多糖、细菌脂多糖、香菇多糖等。研究表明,抗补体活性多糖大多为酸性杂多糖, 其酸性部分主要是半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。从麝香草叶中得到的酸性多糖 (

45、Tv.3.IAII。可以通过经典途径和替代途径激活补体系鲥221。从竹芽中分离 出的组分(BS.BGA可通过替代途径激活补体,其结构是具有B一(1_4侧链 的B.(13葡聚糖【23J。0.1.1.2多糖的抗病毒活性多糖的体内、外抗病毒活性已得到广泛证实,其抗病毒的机制可分两类:一 是对病毒的直接抑制作用,包括对病毒附着细胞、进入细胞以及病毒复制的抑制; 二是间接作用,即调节机体免疫系统、增强抗病毒的免疫反应。病毒必须吸附与 穿入敏感细胞才能引起感染,吸附分为两个阶段,一是病毒体与细胞接触,进行 静电结合,此过程是非特异的、可逆的;二是病毒体表面位点与宿主细胞膜上相 应受体结合,此过程是特异的、

46、非可逆的。这一识别、吸附的过程多由细胞表面 蛋白质和糖蛋白介导。1981年,Rossignol等发现内源性硫酸多糖在细胞吸附和识 别中发挥作用【241。随后在多种形式的细胞吸附与识别研究中,发现硫酸化多聚阴 离子结构起了重要而特殊的作用。利用药物来干扰这些识别吸附过程就可起到抗 病毒作用。病毒进入细胞后要进行DNA的复制、蛋白质的表达以及核酸与蛋白 质外壳的装配等步骤,这些步骤是非常复杂的生物化学反应,筛选的药物能抑制 这些步骤中的某一反应就可以抑制病毒的复制与增殖;另外,药物还可以通过启 动免疫系统来消灭病毒。一些天然多糖和化学修饰的天然多糖对人体免疫缺陷病 毒(HIV、单纯疱疹病毒(HSV

47、、柯萨奇病毒(cvm、巨细胞病毒(CMV、 流感病毒(influenzaAvirus、肝炎病毒等有显著的抑制作用。具有抗病毒活性的 多糖主要是一些硫酸化多糖,自从Nakashim等人报道卡拉胶具有抑制单疤疹病毒 复制的作用以来,硫酸多糖逐渐引起人们的关注【251。硫酸多糖是指糖羟基上带有 硫酸根的多糖,包括天然提取的各种硫酸多糖以及中性多糖的硫酸化衍生物等。 硫酸多糖抗病毒的可能机制:一是硫酸化多糖的多聚阴离子结构,因为病毒对宿 主细胞的感染需经过病毒体表面位点与宿主细胞受体部位的可逆与不可逆结合 两个阶段,硫酸多糖正是在这种结合过程中发挥抗结合的关键作用;二是竞争性 抑制病毒逆转录酶活性,从

48、而阻止病毒的复制,是多糖抗病毒的另一种机制;再 4海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究则是通过增强免疫功能提高机体抗病毒能力。硫酸酯化多糖的抗HIV-1作用, 已经有很多报道,硫酸化多糖为聚阴离子,可以与HIV病毒外膜蛋白上或CD4某些敏感结构域发生相互作用,掩蔽活性区域,从而抑制H对细胞的吸附或融 合,使其不能进入细胞进行复制。抑制病毒原理主要基于阻断HIV-1结合细胞 环节,抑制HIV感染免疫细胞,从而抑制病毒大量繁殖【26-29。硫酸多糖911与 细胞和病毒共同培养,在不同时间内检测培养上清液中的逆转录酶活性,发现硫 酸多糖911对逆转录酶活性有明显的抑制作用。现有学者认为

49、,硫酸多糖分子中 硫酸化侧链与模板引物上的某些酶具有相同的结合位点,从而产生竞争性抑制作 用【301。新近的一些研究又发现硫酸多糖与HIV-1Tat蛋白结合可以抑铝IJHIV-11311。 HIV-1Tat蛋白是一种特殊的转录因子,它能进入细胞,转运至细胞核,刺激 HIV"UR+的转录活性,对病毒的复制和整合起重要作用。硫酸细菌糖胺聚糖对 H有体外抑制活性,它阻止合细胞的形成,阻断病毒对宿主细胞的吸附。加之 硫酸细菌糖胺聚糖的抗病毒活性与抗凝血活性比值较高,引起出血的副作用小, 使其极有可能用于临床p21。Collins等【33】从食用菌Coriolus versicolor中提取到

50、的多 糖肽能抑制HIV-1的gpl20与CD4受体的相互作用,抑制重组HIV-1逆转 录酶;还能抑制作用于病毒蛋白质加工过程的糖羟基化酶的活性。小分子量的牛 膝多糖有免疫增强作用,却无抗病毒活性,经硫酸化处后,产生较强抗乙肝病毒 HBsAg和HBeAg的活性【341;猪茯苓多糖能抑HBV转基因小鼠HbsAg表达, 从而抑制肝炎病毒【35】。从海藻(Sargassum Homert中热水提取的硫酸多糖,通过 抑制病毒的吸附结合及病毒复制而具有抗HSV-I、CMV病毒活性【36J。O.1.1.3多糖的抗肿瘤活性抗肿瘤作用是多糖类化合物所显示的主要生物活性,就多糖的抗肿瘤作用来 说,可将抗肿瘤多糖分

51、为两大类:一类是具有细胞毒性的多糖直接杀死了肿瘤细 胞,这类多糖有牛膝多糖、茯苓多糖、刺五加多糖、银耳多糖、香菇多糖、云芝 多糖等:第二类抗肿瘤活性多糖是作为生物免疫反应调节剂,通过增强肌体的免 疫功能而间接抑制或杀死肿瘤细胞,这与前面提到的多糖的免疫调节活性是一致 的,具有抗肿瘤活性的多糖大多是通过这种途径起作用的,即具有宿主介导的抗 肿瘤活性。研究表明一些多糖对肿瘤细胞有直接作用,从而改变了多糖无细胞毒 性的观点。对肿瘤细胞的直接作用与多种途径有关:影响细胞膜的生化特性,海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究肿瘤细胞膜唾液酸含量的变化与肿瘤发生发展有密切关系,茯苓多糖(PPS、

52、刺 五加多糖(APS在体外对S180、K562有直接抑癌作用,并使肿瘤细胞唾液酸升高, 磷脂减少【37】。进一步研究发现,PPS使S180与K562细胞膜磷脂脂肪酸组成发生 明显改变,PPS干扰膜的肌醇磷脂代谢,明显抑制磷脂酰肌醇转换,推测PPS的 抗肿瘤机理与膜生化特性改变有关【38】。影响肿瘤细胞内信号传递途径:猪苓多 糖通过抑制磷酸二酯酶活性而提高细胞内cAMP水平。进一步的研究发现猪苓 多糖与茯苓多糖对HL260细胞质和胞膜两部分的酪氨酸蛋白激酶活力有不同的 激活作用,提示2种多糖抗肿瘤的机制可能与酪氨酸蛋白磷酸化水平下降有关【391。 诱导肿瘤细胞凋亡:地黄低聚多糖(LRPS能使Le

53、wis肺癌细胞内的p53基因表达 增加,可通过调控p53基因的表达而影响肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡140】。枸杞多 糖对高转移人肺癌PG细胞的细胞凋亡呈时间和剂量依赖性,枸杞多糖诱导的 细胞凋亡以loop咖L最明显14¨。梁金菇多糖则通过增加Caspase23基因表达促使 HL260细胞凋亡【421。抗自由基作用:无花果多糖可提高荷S180dx鼠血清的 SOD、GSH2px活性和降低自由基水平而抗肿瘤f431。海藻多糖能减少白血病L615小鼠脂质过氧化物含量而增加过氧化氢酶、SOD的活力,表明海藻多糖能抑制自 由基的产生和加快自由基的清除,减少或防止原初氢氧自由基和单线态氧的产 生,

54、使细胞分裂发生抑制,导致肿瘤生长抑制】。阻断癌细胞DNA的合成:羟甲基茯苓多糖对人早幼粒白细胞的IC50为58眦,可使G0、Gl期细胞增加, S、G2期细胞下降而抑制DNA的合成【451。抗突变作用:关于癌变机理存在 多种学说,著名的为体细胞多次突变理论。实验研究表明,许多多糖能减少染色 体畸变、SCE和微核的发生率,可用于肿瘤的预防和治疗,如人参多糖可使CTX 诱变的小鼠活体骨髓细胞SCE频率明显下降【46】。黄芪多糖、天冬多糖等均有抗 突变作用H71。多糖抑制肿瘤血管形成:现已证实,实体瘤的生长和转移与新生 血管的形成有密切关系【4引。肿瘤的血管系统己成为1个崭新的有希望的抗肿瘤治 疗靶点

55、。云芝多糖、香菇多糖、虫草多糖等均能诱生n师f49】;黄芪多糖、当归 多糖、党参多糖、猪苓多糖等皆可诱生IFN50】。0.1.1.4多糖的抗衰老活性多糖具有抗衰老作用,其机制一方面作为免疫调节剂上调机体的免疫功能; 另一方面可以增强机体对自由基的清除能力和抗氧化能力,增强机体抗氧化酶活 6海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究力。自由基过剩可诱发炎症、免疫失调、恶性肿瘤等多种疾病,也是促进机体衰 老的因素之一。脂质过氧化是氧自由基损伤组织的重要方式,其损伤途径为:氧 自由基+细胞膜脂质_脂质过氧化反应一过氧化脂质_÷丙二醛+细胞成分_÷脂褐质。可见,脂质过氧化与

56、氧自由基及衰老密切相关;丙二醛和脂褐质是脂质 过氧化的产物,其含量的变化间接反应了氧自由基的含量。机体自身存在抗氧化 系统,SOD是体内重要的抗氧化酶,清除超氧阴离子自由基(023,保护细胞免受 损伤。GSH.Px是体内过氧化氢分解的催化酶,它对活性氧和羟自由基(OH诱 发的脂氢过氧化物及组织产生的H202有较强的清除能力,可以起到保护细胞结构 和功能完整的作用。NOS是L.Arg和分子氧反应生成NO的催化酶,NO是巨噬 细胞发挥功能的关键介质,也是血管舒张必须依赖的因子,高血压、肾炎等多种 疾病状态下体内NO减少。正常情况下,36周龄和60周龄小鼠与10周龄小鼠相 比,体内抗体IgM水平分别

57、降低60%和70%,从紫云英根(Astralus sinucus L 中提取的粗多糖对不同周龄小鼠(10.36.60进行实验,36周和60周小鼠的IgM 水平显著高于相应的对照组,而lO周龄小鼠与对照组相比无差异。提示该多糖成 分科上调老龄鼠的免疫功能【5ll。党参多糖能不同程度对抗衰老机体免疫器官退化 及提高免疫功能,能使胸腺指数和脾脏指数不同程度回升;血清和肝组织中MDA 及脑组织中LF明显降低;血清、肝组织中SOD、肾组织中GSH.Px及NOS酶 活力明显上升。能不同程度地清除OH和抗脂质过氧化:能不同程度地清除 02一,H202及活性氧;可不同程度上调体内NO,提高机体生理机能152。

58、红芪多 糖(HPS能明显延长果蝇的寿命,提高老年小鼠对有害刺激的非特异性抵抗力, 降低动物血浆中过氧化脂质含量,减少脂褐素形成,并可能清除细胞中已形成的 脂褐素【531。螺旋藻多糖(PSP是从螺旋藻中分离纯化获得的平均分子量为 16.6kDa的酸性多糖,对D.半乳糖所导致的衰老小鼠模型有如下作用:抗小鼠肝、 脑组织单胺氧化酶(MAO.B的活性明显提高,抗Na-K.ATP酶活性降低,对抗 小鼠淋巴细胞增殖转化降低的效应,拮抗小鼠皮肤细胞中羟脯氨酸含量降低,从 而防止胶原蛋白多肽链之间交联度的增加,代谢率降低,防止皮肤组织弹性降低 154。女贞子多糖能剂量依赖地抑制衰老模型小鼠胸腺指数、脾脏指数的

59、下降和脑 组织中脂褐质含量的升高;抑制心、肝、肾组织中MDA含量升高和SOD及GSH2Px 活性下降,可显著抑制机体免疫器官退化及提高免疫功能,清除羟自由基,超氧海洋多糖药物PS916的荧光标记及其药代动力学研究阴离子自由基和活性氧,提高抗氧化酶活力【551。波叶大黄多糖能明显延长两性果 蝇平均寿命,具有延缓衰老作用【561。枸杞多糖能提高果蝇平均寿命,有效对抗自 由基过氧化,抑制衰老模型小鼠体内丙二醛和脂褐素含量的增加:降低老年小鼠 血清内MDA含量【571。从中药黄精中提取的一种小分子量中性多糖,在动物实验 中能显著地延长果蝇寿命,促进老龄大鼠学习和记忆能力,改善老龄大鼠血浆 SOD酶活性、肝脏脂褐素含量、心脏过氧化脂质含量和脑组织B型单胺氧化酶活 性等与衰老相关生化指标,与对照药喜得镇相比较,具有疗效相同而副作用小的 特点