热休克蛋白70、 葡萄糖调节蛋白94 和IgG在人肺癌组织中的表达

1、热休克蛋白70、 葡萄糖调节蛋白94 和IgG在人肺癌组织中的表达        【摘要】  目的: 探讨热休克蛋白70（Hsp70）、 葡萄糖调节蛋白94（Grp94）、 IgG在人肺癌组织中的表达及意义。方法: 应用免疫组织化学方法结合病图像分析系统研究40例肺癌组织中Hsp70、 Grp94和IgG的表达。并用免疫荧光双标染色及激光共聚焦技术研究三者的定位关系。结果: 人肺癌组织中Hsp70、 Grp94、 IgG都有高表达, 阳性率分别为65%(26/40)、 45%(18/40)和82.5% (

2、33/40), Hsp70阳性定位胞核胞质, Grp94和IgG阳性定位主要在胞质, 平均光密度值分别为(5.10±0.32)、 (3.52±0.35)和(8.12±0.31)。26例Hsp70阳性的肺癌病例中有10例与IgG有共定位关系, 18例Grp94与IgG有共定位关系。结论: Hsp70、 Grp94和IgG在肺癌组织中高表达, 提示三者在肺癌的发生中起重要作用; 肺癌肿瘤细胞表达的IgG与Hsp70、 Grp94分别存在一定共定位关系, 其在肿瘤的发展中可能具有协同作用或者在肺癌组织中存在Hsp70IgG、 Grp94IgG和Hsp70Grp94IgG

3、复合物的形式。 【关键词】  热休克蛋白70 葡萄糖调节蛋白94 免疫球蛋白G 肺癌 共定位    热休克蛋白(heat shock proteins, Hsp)是一组高度保守的且具有重要生理功能的蛋白质分子, 在一些应激状态下可被诱导表达。研究表明多种肿瘤细胞都有Hsp70的表达, Hsp70的表达和肿瘤细胞的生长和发展可能存在相关性1, 2。内质网分子伴侣Grp94属于Hsp90家族。肿瘤细胞中Grp94的表达增加与细胞的生长存在密切的关系, Grp94的过表达参与了一些肿瘤的形成3。IgG是机体免疫系统中的重要分子, 新近的研究发现, 上皮来源的恶

4、性肿瘤如乳腺癌、 大肠癌、 胃癌及体外培养传代细胞等存在Ig或Ig样物质4。但是, 目前关于三者在肺癌组织中共表达及相互定位关系的意义报道较少, 本研究通过探讨Hsp70、 Grp94、 IgG在肺癌组织中的表达及相互的定位关系, 为进一步研究肿瘤自身免疫机制和肿瘤的免疫、 肿瘤疫苗开发提供理论基础。1  材料和方法1.1  材料 肺癌40例组织标本(2005/2006年患者, 男28例, 女12例, 年龄3776岁, 平均59岁）取自第四军医大学西京病理科（临床及病理明确诊断为肺癌的活检组织块）。小鼠抗Grp94单克隆抗体（mAb）、 小鼠抗Hsp70 mAb、

5、 小鼠抗IgG mAb、 HRPIgG二抗（羊抗小鼠)、 兔抗IgG多克隆抗体、 荧光抗体FITCIgG（羊抗兔）、 Texas RedIgG（羊抗小鼠）均为DAKO公司产品。DAB显色试剂盒为Sigma公司产品。1.2  方法1.2.1  免疫组织化学染色 组织用100 g/L甲醛固定, 石蜡包埋, 做成组织芯片。常规脱蜡至水。组织抗原微波修复10 min。冷却至常温。用10 mL/L过氧化氢室温孵育10 min, 封闭内源性过氧化物酶, 用PBS缓冲液（pH7.4）振洗3次, 每次5 min,  正常羊血清封闭。加一抗(小鼠抗Hsp70 mAb 11

6、00, 小鼠抗Grp94 mAb 1100, 小鼠抗IgG mAb 1100), 37孵育1 h, 用PBS液冲洗3次, 每次5 min, 再加HRPIgG二抗（羊抗小鼠), 37孵育1 h, 再用PBS液冲洗3次, 每次5 min。经H2O2DAB (5 mL PBS pH7.4, DAB 5 g, H2O21 mL)在显微镜下控制显色, 苏木素复染套核, 脱水、 透明及封片。以肿瘤细胞中出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。1.2.2  免疫荧光双标记和激光共聚焦显微镜观察 切片常规脱蜡至水。组织抗原微波修复（柠檬酸盐修复液）。正常羊血清封闭。加一抗(小鼠抗Hsp70 mAb 1

7、100, 小鼠抗Grp94 mAb 1100, 兔抗IgG多抗1100), 37孵育1 h, 用PBS液冲洗3次, 每次5 min。再加荧光二抗（羊抗兔FITCIgG 1200, 羊抗鼠Texas redIgG 1200), 37孵育1 h, 再用PBS液冲洗3次, 每次5 min。甘油封片。激光共聚焦显微镜观察并采图。1.2.3  图像分析及统计学处理  图像采用Imagepro plus5.1分析系统分析。显微镜下每块组织取上下左右中5个显微镜视野采图, 图像分析系统分析每个视野的积分光密度值（IOD）, 然后求平均IOD值。结果采用SPSS11.0统计软件进行统计学处

8、理。2  结果2.1  免疫组织化学染色 Hsp70、 Grp94、 IgG在肺癌组织中阳性反应产物为棕黄色颗粒。本实验结果显示肺癌组织中Hsp70、 Grp94、 IgG都有高表达。Hsp70阳性率为65%（26/40）, 平均光密度值为5.10±0.32（图1）, 胞核、 胞质都有阳性反应产物（图2）。Grp94阳性率为45%（18/40）, 平均光密度值为3.52±0.35（图1）, 阳性定位主要在胞质（图2）。IgG阳性率为82.5%（33/40）, 平均光密度值为8.12±0.31（图1）, 阳性定位主要在胞质（图2）。2.

9、2  免疫荧光双标染色及激光共聚焦显微镜观察  镜下明亮的绿色荧光(FITC)显示肺癌组织中IgG, 荧光主要定位在胞质中（图3）; 红色荧光(Texas Red)显示肺癌组织中的Hsp70、 Grp94, Hsp70荧光胞核胞质都有, Grp94荧光主要定位在胞质中（图3）; 黄色荧光显示IgG与Hsp70、 Grp94存在共定位关系（图3）。26例Hsp70染色阳性的肺癌病例中有10例与IgG存在共定位关系, 18例Grp94与IgG存在共定位关系（图3）。3  讨论    大量研究表明, Hsp在肿瘤组织中呈高水平表达。本研究发

10、现Hsp70 Grp94 在肺癌组织中也是高表达的。新近研究发现Hsp与肿瘤关系密切, 可与癌基因、 抑癌基因及其产物相互作用调节肿瘤细胞的增殖和异型分化5, 6。且Hsp70与原癌基因crnyc、    抑癌基因p53关系密切7。Abdel等8报道, Hsp70与cmyc蛋白、 p53蛋白的结合抑制了Hsp70与靶分子MHCI类分子的结合, 从而阻止MHCI类分子细胞表面的转运和表达及向NK细胞和T淋巴细胞提呈肿瘤特异性抗原, 这可能是肿瘤细胞的免疫逃逸机制之一。成瘤细胞合成大量的Grp94的能力使其能抵抗具有免疫活性宿主的不利条件而获得成瘤性。有资料显示Grp

11、94与人肺癌的发生发展有关。Grp94表达的升高可能是人肺癌的一个特征9。Grp94在肿瘤细胞中作为主要的肿瘤排斥抗原, 引发针对该肿瘤细胞的特异性免疫反应。已证实提取的Hsp70和Grp94具有分子伴侣和免疫佐剂效应, 能够相伴肿瘤抗原肽, 激活免疫细胞特异性攻击肿瘤细胞10, 11。抗瘤机制在于其作为伴侣促进抗原肽在MHC I类分子的承载, 因而增强了肿瘤抗原肽在MHC I类分子上的提呈11。而且Hsp70或Grp94相伴肽还可以作为超抗原直接激活T淋巴细胞或杀伤细胞而不用依赖刺激MHC I类分子12。通过这些方式诱导CTL细胞毒反应和激活抗瘤免疫效应。1   

12、0;         IgG是免疫系统中的重要分子, 经典的免疫学理论认为, 免疫球蛋白是B淋巴细胞的特征产物。而有研究表明上皮性肿瘤也能分泌IgG且可促进瘤细胞的生长13。这是传统免疫学所面临的一个新问题。有学者用各种方法证实多种上皮源性肿瘤细胞可以衍生IgG样物质。反义的寡核苷酸阻止IgG的表达在体外可以抑制肿瘤细胞的生长; 抗IgG抗体可以诱导分泌IgG的肿瘤细胞退化; 结果也间接显示IgG可能促进肿瘤细胞的生长4。这可能揭示了一种新的肿瘤细胞生长机制并发现了一个新的调控肿瘤细胞生长进化的靶点。本研究发现肺癌

13、组织中的IgG表达阳性率及阳性强度较高, 提示IgG的表达在肺癌的发生过程中的普遍存在。发展针对肿瘤来源IgG的选择性阻滞剂可能是一种新的肿瘤免疫的方法。    实验中发现, IgG和Hsp70、 Grp94的免疫组化染色表现非常相似, 2005年我们曾发现在肝癌细胞中IgG和Hsp70这2个重要分子存在共定位14。本实验不仅进一步揭示了Hsp70和IgG有共定位关系, 而且还发现Grp94和IgG也存在一定的共定位关系。这可能是某些肿瘤发生、 发展的机制之一。提示Hsp70、 Grp94和IgG在肿瘤的发生、 发展中具有协同作用, 或者肺癌组织中可能有Grp94

14、IgG、 Hsp70IgG或Hsp70IgGGrp94的复合物的存在。其共同作用于肿瘤发生发展的某一环节, 参与肿瘤的自身免疫防御和免疫逃逸。肿瘤细胞中免疫复合物的形成可能保护肿瘤细胞免受免疫攻击而促进肿瘤细胞的生长。但具体的作用机制需要进一步的探索。【】  1 Labret T, Watson RW, Molinie V, et al. Heat shock proteins Hsp27, Hsp60, Hsp70, and Hsp90: expression in bladder carcinomaJ. Cancer, 2003, 98(5): 970-977.2 Wang XP

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