温通针法对脑梗塞大鼠血小板膜糖蛋白CD62P和CD63的影响

1、温通针法对脑梗塞大鼠血小板膜糖蛋白CD62P和CD63的影响                               作者：杨波 高洋 严兴科 郑魁山【摘要】  目的探讨温通针法对急性脑梗塞大鼠血浆糖蛋白含量的影响。方法选用健康Wistar大鼠，用线栓法直接阻断大鼠大脑中动脉制作急性脑

2、梗塞模型，采用流式细胞仪测定脑梗塞大鼠血浆CD62P和CD63的含量。结果造模后脑梗塞组血浆CD62P，CD63均较假手术组显著升高；两组血浆CD62P，CD63均 较梗塞组显著降低，且温通针法较捻转针法降幅更为显著。结论针刺可以通过降低脑梗塞大鼠血浆糖蛋白含量，从而阻止或抑制血小板活化，达到防治脑梗的目的，而温通针法的作用优于捻转针法。 【关键词】  1.长春中医药大学针灸推拿学院，吉林长春 130117； 2.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000针刺在治疗脑源性疾病方面疗效显著，尤其是对急性脑梗塞的治疗，日益引起重视。多年的基础研究和临床实践表明，针刺在治疗脑梗塞等缺血性中风方

3、面疗效显著，但传统针刺手法治疗该病的研究则鲜见报到。导师郑魁山教授数十年来运用独创的“温通针法”在临床治疗缺血性卒中方面取得满意的疗效，表明其对脑梗塞是有效的。血小板活化在缺血性脑损伤中起重要作用，而CD62P和CD63作为血小板活化的分子标志物，能够反映血小板被激活的程度1。为进一步探讨传统针法防治脑梗塞的机理，进行如下实验观察。    1   材料与仪器    1.1  动物  Wistar大鼠48只，雌雄各半，体重（230±20）g，由兰州医学院实验动物室提供。分组：实验前适应性

4、喂养3天后将48只大鼠随机分为：假手术组、中动脉梗塞组（简称梗塞组）、捻转补法组（简称捻转组）、温通针刺组（简称温通组），（每组12只）。    1.2  器材低温超速离心机（Heracus）;FACS Calibun型流式细胞仪美国Becton Dickinsua公司；血小板单克隆荧光抗体（Inmunototach公司）。    2  方法    2.1  急性脑梗塞大鼠模型复制2，3复制并改良脑梗塞模型。大鼠以20乌拉坦（7m1/kgbw）腹腔注射麻醉，仰卧位固定，颈正中

5、切口，仔细分离、结扎右颈总动脉、颈外动脉及其分支，分离右侧颈内动脉（Internal Carotid Artery,ICA），近段备线，远端放置动脉夹。于颈总动脉上距分叉处0.5cm处切口。插入1.5号尼龙线（头端涂以硅胶，使成为直径约0.25mm左右，具备一定弹性和硬度）1820mm，使线栓进入ICA，穿过大脑中动脉（Middle Cerebral Artery, MCA），起始段至大脑前动脉近端，阻断MCA的所有血液来源，结扎备线，减去多余线头，缝合皮肤。在手术结束，麻醉清醒后，观察神经症状，按照Kuluz神经缺陷三级评分表4，选择符合条件者，即行走时身体向偏瘫侧转圈者作为观察对象。假手术

6、组只分离ICA而不用线栓阻塞MCA血流。    2.2   腧穴的选取、定位及针刺方法  腧穴的选取、定位：根据郑魁山教授治疗中风的经验选取人中、足三里（双），参照实验针灸学5“大鼠常用针灸穴位定位标准”定位取穴。    针刺方法： 温通针法，参照郑氏温通法进行操作6。 捻转补法，参照教材7标准进行。每穴操作90s。捻转组于造模即刻、造模后3h各行捻转针法1次，温通组于造模即刻、造模后3h各行温通针法1次，以上每穴操作90s；假手术组、脑梗塞模型组不予处理。    2.3&#

7、160;  观察指标和方法各组大鼠于治疗结束后空腹采取静脉血1ml，加消炎痛EDTA溶液100l抗凝，于低温超速离心机（3500r/min）离心20min，分离血小板血浆，调整血小板浓度为300×109/L，加入20l血小板单克隆荧光抗体（Immunototech公司）即CD62P和CD63，分别与50l血小板血浆混匀，室温下反应20 min加入0.5ml PBS液，用FACS Calibur型流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）进行检测。用Cell Quest软件进行样本收集和数据分析，全部数据以±s表示，多组比较采用F检验和q检验进行统计学分

8、析。    3  结果    各组动物血小板膜糖蛋白CD62P和CD63含量比较。结果见表1。表1  各组动物血小板膜糖蛋白CD62P和CD63含量比较 与假手术组比较 P<0.01；与脑梗塞组比较 P<0.01；与捻转组比较 P<0.05， P<0.01    表1说明，造模后脑梗塞组血浆CD62P，CD63均较假手术组显著升高；而两治疗组治疗后血浆CD62P，CD63 较脑梗塞组显著下降；而且温通组与捻转组相比，其治疗作用更为明显，特别是CD62P差异有非常

9、显著意义。    4  讨论    4.1  脑梗塞的病理生理机制脑梗塞的基本病机是脑脉瘀阻，以致窍闭神匿，肢体不用。大脑中动脉是缺血性脑血管病的易患部位，在脑梗塞患者中，大脑中动脉主干分布区梗塞占82.2%8，故采用线栓法制作中动脉部位局灶性脑梗塞模型与临床实际较为符合。而在脑梗塞的病理生理过程中，血小板膜糖蛋白在血小板黏附于血管壁及相互聚集形成血栓的过程中起着关键作用。血小板膜表面受体与配体间的相互作用具有调节血小板黏附、聚集及信号转导等功能。在多种血栓性疾病过程中，血小板活化程度增高参与疾病的发生和，其中活化

10、的血小板膜糖蛋白发生显著变化，特别是血小板活化依赖性颗粒表面膜蛋白是血小板活化和释放反应最具特异性的标志物，可作为体内血栓形成标志及体内定位诊断的靶子9。1             脑梗塞时由于血管内皮损伤，内皮下胶原暴露使血液中血小板被激活。其膜上构型的改变及重排导致血浆内多种粘蛋白的结合，血小板内颗粒上的CD62P迅速转移到血小板表面，同时血小板内溶酶体蛋白CD63也可随着活化的脱颗粒反应而表达于血小板表面10。另有研究发现血小板CD62P具有介导活化血小板或内皮细胞与中性粒细胞及

11、单核细胞的黏附功能11，在脑缺血过程中起重要作用。还有人发现CD62P水平与梗塞最大直径呈正相关12，说明血小板活化程度与梗塞灶大小有密切关系。因而CD62P和CD63可作为脑梗死病情判断的一个指标，为临床评价脑梗塞的血小板活化程度提供了早期特异性指标，并对脑梗塞患者防治有重要意义。    4.2  针刺防治脑梗塞的机理探讨针刺脑梗塞的研究报道很多，然而选用适当手法开展的研究则不多见。本实验选用健康Wistar大鼠，不存在“邪气盛”或“正气虚”的问题。而造模后，阻断了大脑中动脉，使血脉闭阻，血宛于上；血不行则气无所载，致使气血逆乱，气滞血瘀；血不利则化为

12、水，气不行津，聚湿生痰。痰随气而无处不到，脑为人体真气所聚之处，故痰极易凝滞于经络和脑窍，导致痰蒙脑窍或阻滞经络。大鼠在造模后喉中有强烈痰鸣音也支持这一点。故本模型相当于中风之中脏腑，而淤血痰浊蒙闭清窍是其主要病机。故腧穴首选督脉之要穴人中以醒神开窍，启闭开蒙，升阳通气；而大脑中动脉闭阻，依据“胃者五脏之本”、“凡欲治病者，必须顾护胃气”的原则配以足阳明胃经的合土穴，亦是回阳九针穴之一的足三里治疗。而手法选取则根据素问·调经论“血气者，喜温而畏寒，寒则涩不能流，温则消而去之”的原则，施以导师郑魁山教授的特色手法“温通针法”，以“温淤化浊，通经调气”从而达到“血脉和利，精神乃居”的效果

13、。    本实验中造模后脑梗塞组血浆CD62P，CD63均 较假手术组显著升高（P<0.01）；而两治疗组治疗后血浆CD62P，CD63 较脑梗塞组显著下降（P<0.01）；而温通组与捻转组相比，治疗效果更为明显（P<0.01，P<0.05）。提示针刺是通过改善血管异常收缩，缓解痉挛，抑制血小板的异常聚集，特别是减轻了血小板的活化程度，阻止或减轻血小板和粒细胞的黏附作用，使缺血区及时有效得到更多血流，从而防止了血栓的继续加重，缩小梗死灶，起到减轻脑损伤的作用。    从本实验的结果来看，温通针法在抑制血小板异常

14、聚积或血栓形成方面优于捻转针法。其作用机制13可能是不同针法的刺激性质和强度不同引起穴下感受器兴奋的强度和类别存在差异，经中枢相同和不同核团整合后，传出信号影响中枢神经递质系统，释放出多种神经递质或激素，在不同水平上同时对多个系统、器官产生影响，才得以使不同的针法产生不同的针刺效果。这也在某种程度上体现了在治疗缺血性中风方面针刺治疗较药物治疗更具有优越性。因为针刺发挥作用可以不须依靠血液做载体，它可以刺激神经而通过反射作用直接到达靶器官和靶细胞，发挥快速、即时的直捷效应。而组化和电镜研究14已证实不仅较大的血管受神经支配，就是终末微动脉、毛细血管及小静脉亦均受神经支配，这为针刺通过神经途径发挥

15、直捷快速效应提供了有力的佐证。由于这一过程较为复杂，其更详尽的机制及发挥作用的另外可能途径，有待于以后的深入研究和探讨。【】  1 Haas S, Walenga JM, Jeske UP, et al. Heparin-induced thrombocytopenia: the role plateletactivation and therapeutic implicationJ.Semin Thromb Hemost, 1999, 25(suppl):67.2 贾健民, 贾健平,张 昱,等. Wistar Rat全脑反复缺血再灌注动物模型及行为学研究J. 中风与神经病杂志,19

16、92,9（2）:71.3 Kameyama M, Suzuki J,Shirane R. A new model of bilateral hemispherc ischemia in the ratJ. Stroke,1985,16:489.4 Kuluz JW, Prado RJ, Dietrich D,. The effect nitric oxide synthase in hibition on infarct volume after reverible focal ischemia in conscious ratsJ.Stroke,1993,24(12):2023.5 林文注.

17、 实验针灸学,第1版M.上海:上海科技出版社,1994：287.6 郑魁山. 针刺补泻手技M. 兰州：甘肃科技出版社,1995：89.7 杨兆民. 刺法灸法学,第6版M.上海:上海科技出版社,1996：22.8 Tsuchidate R. Regional cerebral blood flow during and after 2 hours middle cerebral artery occlusion in the ratJ. J Cere Blood Flow Metab, 1997,17:1066.9 Sedlmayr P, Grobhaupt B, Muntean W. Flow cytometry detection of intracellular platelat antigensJ. Cytometry, 1996,23:284.10 Latsen E, Celi A, Gilbert GE, et al. PADGEM proten receptor that mediates interaction of activation p