PAGE,SDS-PAGE电泳分离ppt课件

1、华南师范大学生命科学学院 聚丙烯酰胺凝胶的构成 丙烯酰胺和甲叉双聚丙烯酰胺为聚合单体,在聚合催化剂的催化下,聚合为聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化剂过硫酸铵和四甲基乙二胺(TEMED)光和化学核黄素聚合单体丙烯酰胺的浓度和凝胶孔径的关系聚丙烯酰胺凝胶通常由浓缩胶和分别胶组成浓缩胶:丙烯酰胺浓度均为4%,起蛋白上样和浓缩的作用分别胶:起分别蛋白的作用, 丙烯酰胺浓度可以是一样的(均一胶),也可以是不同的(梯度胶)分别胶的丙烯酰胺浓度由上至下构成从低到高的延续梯度,普通是4%-20%分辨率高可延续上样电泳时间长可消除电荷对迁移率的影响 需采用梯度混合器，配制时，浓溶液置于混合室，稀溶液置于储存室 用pH8

2、.3的电泳缓冲液，电泳向正极进展.下槽接正极，上槽接负极，以溴酚蓝为指示染料 最常用 可用于分析绝大多数的蛋白酶，由于其pI4.0的蛋白均适用蛋白泳动与蛋白大小，电荷和外形有关，凝胶兼有分子筛的功能电泳的分辨率很高，可以把不同的蛋白酶分开一条带阐明纯度高电泳纯蛋白酶外形和大小全酶分子量 分析蛋白酶的全酶分子量电场强度溶液pH值离子强度电渗全酶分子量的对数(Log Mr)和泳动间隔成反比 PAGE的局限性假设蛋白和杂蛋白的pI相差很大，也要留意有些杂蛋白容易被忽视，由于两者泳动方向不同蛋白和电泳缓冲液的pH一样，蛋白不会泳动假设蛋白酶不同的多聚态并存，纯度高但也能够呈2-3条带电泳和其它方法如H

3、PLC高压液相色谱结合起来，判别蛋白酶的纯度会更可靠!巯基乙醇使蛋自中的二硫键复原1g蛋白和1.4g SDS结合构成蛋白-SDS胶束。SDS带大量的负电荷SDS破坏蛋白质的非共价键各种蛋白-SDS胶束均带负电,且电荷量相近,电泳迁泳率只取决于胶束(亚基Mr)大小使含有亚基的蛋白质解离为各个亚基蛋白-SDS胶束长轴的长度和蛋白亚基Mr成正比蛋白-SDS胶束在水溶液中都成椭圆形，其短轴长度都为18A左右测定蛋白亚基Mr研讨蛋白纯度可结合PAGE 、HPLC、IEF等研讨蛋亚基组成分辨率高(假设是梯度胶)方便易行是蛋白组学研讨的中心技术准确度高(测定误差不超越10%)SDS负电荷量远高于蛋白的电荷量

4、，不同蛋白之间的蛋白-SDS胶束的电荷是近似的蛋白-SDS胶束均为椭圆形,蛋白之间的胶束的分子外形是近似的蛋白-SDS胶束中蛋白/SDS比例并非都是 1:1.4同一蛋白能以不同的比例和SDS结合蛋白-SDS胶束甚至可以带负电荷蛋白-SDS胶束中蛋白电荷量并非都可以忽视空间位阻妨碍蛋白和SDS的充分结合糖蛋白:糖蛋白的糖基会构成空间位阻,亚基Mr的对数与其电泳迁泳率不成线性关系蛋白受体:二硫键丰富,不容易彻底解离为亚基,所测亚基Mr会偏高含辅酶的复合蛋白，多酶复合体等:其亚基Mr能够测不准碱性组蛋白和酸性铁氧还蛋白在SDS-PAGE所测亚基Mr偏高组蛋白亚基Mr为21kD，但测定出为35kD 组

5、蛋白的正电荷抵消了SDS部分负电荷铁氧还蛋白的亚基Mr只需8kD，但Rf=0.8铁氧还蛋白不能和SDS充分结合强碱性的精蛋白在SDS-PAGE中会沉淀能够是精蛋白的正电荷和SDS的负电荷相差无几磷酸化前后的蛋白激酶能以不同的比例和SDS结合其构象会发生改动，妨碍了蛋白和SDS的结合SDS-PAGE中所测亚基Mr会偏高经磷酸化后，会使激酶的负电荷添加， 不同Ca2+浓度下的钙调蛋白的疏水性质不同 疏水性质不同导致和SDS结合的比例不同 导致钙调蛋白有不同的大小铁氧还蛋白和钙调蛋白是酸性蛋白，无论能否和SDS结合和结合程度如何，在碱性电泳系统的SDS-PAGE中均向负极泳动，只是迁移率不同而已假设

6、碱性蛋白和SDS结合率很低，达不到1:1.4,它就能够向负极泳动。碱性蛋白能充分和SDS结合，但其所带正电荷比SDS负电荷还要多，使蛋白-SDS胶束带正电，同样会向负极泳动菜心绿叶粗蛋白经SDS-醋酸纤维素薄膜电泳,下方为正极,箭头处为蛋白样品点样的位置正极负极菜心(A)和生菜(B)绿叶粗蛋白经SDS-醋酸纤维素薄膜电泳,下方为正极,箭头处为蛋白样品点样的位置正极负极AB见:梁秀文等.植物绿叶粗蛋白在SDS-PAGE中向负极泳动的富含苯丙氨酸的碱性蛋白的测定. 热带亚热带植物学报,2019,142：126-129 Fig.SDS-denatured glycolate oxidase from

7、 B. campestris ssp. chinensis var. utillis leaves was subjected to SDS-PAGE (A), CE (B) and acetate cellulose membrane electrophoresis (C). The polarity was shown and the arrow indicates the original of protein sample 见:曾秋莲等. 植物中在SDS-PAGE中向负极泳动的富含苯丙氨酸的蛋白的发现. 中国生物化学与分子生物学报, 2019, 22(1):86-90很多蛋白经一些方法

8、证明是纯的，如SDS-PAGE后只需单带，但IEF却含多个pI。目前对其中的缘由众说纷纭，尚无公认的解释，有人以为是空间构象不同所引起，但未有确切的证据。猪生长激素经SDS- PAGE后只需28kD带，IEF却有6.0-7.2等五个pI。猪生长激素能够含两种不同的亚基，其中28kD是个普通蛋白；而另一个亚基那么在SDS -PAGE中是向负极泳动，因此被忽视 在电泳系统中参与两性电解质载体，通电后，载体两性电解质即在电场中构成一个由负极到正极延续变化的pH梯度 当蛋白质,酶或多肽进入这个pH梯度时，不同的蛋白质会不断地泳动,直至到达(聚焦)与其pI相当的pH位置上 用于分别具有不同pI的蛋白和测定蛋白的pI 分别仅仅决议于蛋白质的pI。电泳中区带越来越窄，抑制了其他电泳中存在的分散作用。 一旦蛋白质到达它的等电点位置，它就没有净电荷，蛋白质只能在它的等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的带不论样品加在什么部位，都可以聚焦到与其等电点相当的pH的位置可将pI仅相差0.01-0.02pH单位的蛋白质分开早期发现谷氨酸，组氨酸或赖氨酸能产生大约1pH的梯度但pH范围太窄，且缓冲才干不够蛋白质分子本身也是两性电解质，在电泳时，它会影响梯度的pH以便在IEF后两性电解质不干扰蛋白的检测 以便在IEF后易于分开蛋白和两性电解质 不干扰酶活性测定 不干扰免疫检测不