转化生长因子拨3在子宫肌瘤组织中的表达和消Y煎膏的干预作用

1、转化生长因子?拨?3在子宫肌瘤组织中的表达和消?Y煎膏的干预作用 作者：蒋秋燕 唐厚秀 蒋桂秀 苏莉鸣, 唐乾利【摘要】 目的研究消?Y煎膏对大鼠子宫肌瘤以及子宫肌瘤中TGF-3的影响。方法造模大鼠60只，随机分成5组，每组12只：实验组消?Y煎膏分高、中、低3个剂量组，直肠给药；中桂组，予桂枝茯苓胶囊溶液灌服，每次0.5 ml/kg；模型组。另设空白组12只，每天灌服0.9%生理盐水，0.5 ml/kg/次，以上各组均给药3次/d，共4周。停药后第1天内处死大鼠，立即取标本实验研究。结果治疗组大鼠子宫重量明显减轻，宫颈和宫体处最大直径显著缩小，与模型组比治疗组子宫系数降低明显；实验组3个剂量

2、的TGF-3水平与模型组比较P0.05，有显著意义；中桂组与模型组比较，P0.05；模型组与空白组比较，P0.01，有非常显著意义。结论消?Y煎膏能使子宫肌瘤缩小，明显降低TGF-3表达，抑制子宫肌瘤细胞增殖，使肌瘤缩小，因此推测其内可能含有TGF-抗体类物质在起作用。 【关键词】 消?Y煎膏 直肠给药 子宫肌瘤 转化生长因子-3子宫肌瘤（UL）是女性生殖系统最常见的良性肿瘤，主要由子宫平滑肌细胞增生而成，其间有少量纤维结缔组织1。分子生物学研究显示UL的发生与众多生长因子及细胞因子有关，这些因子以自分泌或旁分泌方式促进子宫平滑肌细胞增殖，形成一个复杂的因子网络，在UL中这些生长因子源于平滑肌

3、细胞，又作用于平滑肌细胞促进其增殖。在子宫肌瘤培养细胞中分别加入相等质量浓度的TGF-1与TGF-3,结果均发现培养细胞中纤维结合蛋白mRNA的水平上升,而加入TGF-3上升更明显。Arici等2也研究证实在子宫肌瘤和肌层细胞中加入TGF中和抗体1型和3型胶原蛋白mRNA显著下降。因此，抗TGF物质可以抑制子宫肌瘤生长，TGF-抗体是一种可能用于治疗子宫肌瘤的新药。中医中药在降低生长因子、细胞因子表达方面有着非常明显的效果。如何寻找一种更为有效的中草药，抑制或降低UL中生长因子的表达，正是本实验的主要目的。1 器材1.1 对象两个月龄左右雌性大鼠Sprague Dawley(SD)品系(以下简

4、称大鼠)。动物由广西医科大学实验动物中心提供，符合健康一级动物标准。合格证号：桂检证1.2 药物及试剂消?Y煎膏，广西中医药研究所研究所提供，批号20061028；苯甲酸雌二醇注射液（2 mg/ml）,上海通用药业股份有限公司产品，批号20051102；黄体酮注射液（20 mg/ml）,上海通用药业股份有限公司产品,批号050901。桂枝茯苓胶囊(0.31 g/粒)，江苏康缘药业股份有限公司产品，批号200609；兔抗人多克隆TGF-3及SABC即用型试剂盒均购自上海蓝创生物科技发展有限公司产品，批号050102。1.3 仪器石蜡切片机（英国），Olympus 生

5、物显微照相系统（日本），Siemens DME2冰箱（德国），Cmias-2000真彩色病理图像分析系统软件(北京麦克奥迪公司)，电子秤 JD1000-2(沈阳龙腾电子称量有限公司)。2 方法2.1 复制大鼠UL模型本实验参照文献3，4的实验方法，综合其优点造模。购回大鼠86只，体重180220 g，适应性饲养1周。随机抽出14只作空白对照组, 不加任何干预因素,颗粒麦麸喂养；其余大鼠进行造模，每只肌注苯甲酸雌二醇0.12 mg/0.06 ml，3次/周；每只肌注黄体酮1 mg/ 0.05 ml，1次/周；共15周。造模过程中模型组大鼠死亡2只（第51天死亡1只，第68天死亡1只），分析原因可

6、能为：人为摔伤致死。尸检示：子宫直径稍增大，血管数量增多并且增粗充盈，尚未见肌瘤形成。 第15周最后1天，从造模组中随机抽取大鼠10只,对照组2只, 称重，断头处死,剖腹观察子宫形态，测量宫颈、宫体最大直径，称子宫重量，计算子宫系数(子宫重mg/g体重)，然后用10%福尔马林溶液固定，取其最大横切面，石蜡包埋切片，HE染色，Olympus显微镜下测子宫壁肌层情况。 成瘤的判断标准5：子宫肌细胞显著增生，体积增大，排列密集;核体积增大，核仁肥大，见少数畸形核;细胞内含有丰富的有致密小体的肌微丝，线粒体肥大增生，数目增加，嵴模糊，粗面内质网扩张，游离核糖体增多;细胞周围可见大量增生、紊乱、排列不规

7、则的胶原纤维。本实验造模病理切片及大体标本图片如下图：正常大鼠子宫组织切片见图1（HE染色200），模型大鼠UL组织见图2（HE染色200）；模型鼠与空白组大鼠子宫各项指标以及造模抽样结果见表1。2.2 分组及给药方法把造模成瘤的60只大鼠，随机分成5组，每组12只：消?Y煎膏高、中、低3个剂量组（分别简称中高组、中中组、中低组）、模型空白对照组（简称模型组）、桂枝茯苓胶囊组（简称中桂组）；另设空白对照组（简称空白组）亦12只，每组动物体重无显著性差异。 给药方法：给药前轻按摩大鼠肛门,促其排便,以小棉栓沾消?Y煎膏纳入肛门约0.5 cm处。如发现有药栓排出,及时补上，给药期间称体重1次/周，

8、随时调整给药剂量。共给药4周，停药后第1天内处死大鼠，处死当天不给药。中高组按1.632 ml/（kg?d）(相当于成人用量30倍)；中中组按0.816 ml /（kg?d）(相当于成人用量20倍)；中低组：按0.40 ml/kg?d(相当于成人用量10倍)，均直肠给药，3次/d。中桂组予桂枝茯苓胶囊溶液灌服，0.5 ml/（kg?d）/次，3次/d。模型组以及空白组：每天灌服0.9%生理盐水，0.5 ml/次，3次/d。2.3 检测项目2.3.1 一般观察实验期间要注意观察大鼠的精神状态、皮毛的色泽、状态，饮食、体重、粪便、发情周期、对外界刺激的反应能力以及活动休息时的情况：休息的姿势、眼裂

9、大小、黏膜色泽等，做出与用药前的对比分析。表1 模型鼠与空白组大鼠子宫各项指标以及造模抽样结果(略)2.3.2 大鼠TGF-3的测定将切除的新鲜肌瘤及部分正常子宫肌组织用10%甲醛液固定48 h,继而制备蜡块，5 m切片，免疫组织化学染色, 兔抗人多克隆TGF-3及SABC即用型试剂盒，按试剂盒说明书严格操作。 百事通操作流程：脱蜡、水化PBS洗两次各5 min用PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭10 min，蒸馏水洗3次抗原修复PBS洗5 min滴加10%正常羊血清封闭液，室温20 min。甩去多余液体滴加抗, 371 h（4过夜后再37复温45 min）PBS洗3次，2 min/次滴加

10、生物素化二抗，2037，20 minPBC洗3次，2 min/次滴加试剂SABC，2037，20 min-PBS洗4次，5 min/次：自配显色剂显色（为了方便镜下掌握显色程度蒸馏水洗,苏木素复染2 min，盐酸酒精分化100%乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、镜检。2.4 结果判定用组织评分(II-score)法6，以胞浆或胞膜出现着色为阳性标记。i代表染色深浅，共03分：0分，未出现染色；1分，胞浆胞膜呈淡红色或红褐色；2分，红色；3分，深红色或红黑色。Pi代表每一着色程度的细胞所占比例，为（0100）%。H-score=Pi(i+1)，满分为4分。每个切片选择4个视野，每个视野测定3次

11、后取平均值，由同一人使用同一台仪器测定。2.5 统计学处理所有结果采用SPSS11.5软件包进行处理，用s进行描述，组间及组内比较采用单因素方差分析里面的多重组间比较。3 结果3.1 一般观察结果造模期间大鼠精神状态欠佳，皮毛色泽稍干涩，毛易脱落，饮食比造模前有减少，对外界刺激呈防守状态，攻击性强，休息时易惊，粪便一般较黏稠，偶有少许淡红色分泌物附着，味腥臭。体重增加约4065 g。 实验后，大鼠精神状态逐步好转，皮毛色泽稍光滑，毛发脱落有改善，饮食增加，对外界刺激呈防守状态，攻击性减低，休息时易惊状态好转，粪便正常。体重增加约1023 g。各组实验大鼠子宫各项指标情况见表2。表2 消?Y煎膏

12、对实验大鼠子宫各项指标的影响 (略)实验组大鼠子宫系数(%)、宫颈最大直径、宫体最大直径与模型组比较有显著意义，说明消?Y栓能使UL缩小，有治疗UL作用。3.2 大鼠TGF-3的测定结果用药前各组大鼠切片图形及TGF-3表达情况：大鼠正常子宫组织切片见图3（HE染色200），大鼠UL组织见图4（HE染色200），TGF-3表达见图5（免疫组织化学染色200）。研究表明，实验结果显示实验组3个剂量均能降低UL中的TGF-3水平，说明消?Y煎膏中可能含有拮抗TGF-3表达的中药成分。实验组3个剂量的TGF-3水平与模型组比较P0.05，有显著意义；中桂组与模型组比较P0.05；模型组与空白组比较，

13、P0.01，有非常显著意义；3个实验组与中桂组比较P0.05，差异无显著性。消?Y煎膏干预后（用药后）各组的组织切片图形TGF-3表达情况：大鼠空白对照组见图6（HE染色200），各组的组织切片图形TGF-3表达情况见图711（均采用免疫组织化学染色200）。TGF-3在子宫肌瘤瘤边、肌瘤中心、子宫肌层中的表达情况分别见表3和图12。4 讨论4.1 直肠给药的依据汉代医学家张仲景，首创了世界上最早的肛门煎膏剂和灌肠术的外治法。用蜂蜜炼制“蜜煎导”煎膏和猪胆汁、土瓜根等导入肛门治疗便秘等病。现代医家利用该法治疗多种疾病：黄同德等7用清热解毒、活血化瘀、软坚散结类中药灌肠治疗84例慢性盆腔炎，痊愈

14、68例,显效11例,好转3例,无效2例,其中1例不能坚持治疗，治愈率:80.9%，有效率:94%。对照组:用青霉素钠320万单位加甲硝唑注射液0.2静滴,治疗57例患者痊愈14例,显效4例,好转3例，无效36例，治愈率:24.6%，有效率:31.6%。治疗组明显优于对照组。祝晓波8则用自拟中药灌肠治疗放射性直肠炎56例，治愈5例,显效43例,有效8例,显效率85.71%。以上资料均表明直肠给药不失为一种有效的治疗手段，尤其是直肠给药在治疗妇科疾病方面有一定的特色与优势。表3 TGF-3在瘤边、肌瘤中心、子宫肌层中的表达情况(略)放射性同位素研究报道，不经肝脏而吸收的药物，据相应的给药部位计算，

15、为总给药量的5075。宫歧顺认为：药物的吸收与其给药部位有关。认为在大鼠直肠0.5cm处放置栓剂，发现有75的物质吸收入体循环，25%入门脉，而在占大鼠直肠长约2/3处，则证明各有50的物质进入体循环和门脉9。发现经肛门给药比口服和注射刺激小、疗效好、作用快，不仅是治疗肛门直肠局部病变好方法，而且是全身给药的一个比口服和注射有更多优点的途径。因直肠粘膜没有角质层，药物透入较容易、速度快，但此处皮肤较为娇嫩，不耐刺激，用药要求高。所以给药时要注意操作仔细、用药足量、尽量避免不必要的重复操作；为防止药物被排出，选择小棉栓沾药纳入直肠，尽可能的使用药时间与用药剂量达到实验标准，减少外因对实验结果的影

16、响。4.2 消?Y煎膏直肠给药对子宫肌瘤模型鼠TGF-3的作用TGF-超家族成员TGF-3在子宫肌瘤组织中的表达有明显意义。1992年Nelson推测在肌瘤生长中EGF和TGF，可能是一对互补因子，但是TGF作用可能更加重要，E2可以使大鼠子宫TGF的mRNA表达增加，而且是EGF的30倍。研究表明，抗TGF物质可以抑制子宫肌瘤生长，TGF-抗体是一种可能用于治疗子宫肌瘤的新药。TGF-抗体与TGF-结合，通过抑制肌瘤组织纤维化及细胞外基质的沉积，可能达到治疗子宫肌瘤的目的。 本实验制剂消?Y煎膏为活血化瘀、消?Y散结类中药，研究发现消?Y煎膏能明显降低TGF-3表达，抑制子宫肌瘤细胞增殖，使

17、肌瘤缩小，因此推测其内可能含有TGF-抗体类物质在起作用。【参考文献】 1乐 杰.妇产科学，第6版M.北京：人民卫生出版社，2005：295.2Arici A, Sozen I. Transforming growth factor-3 is expressed at high levels in leiomyoma where it stimulaters fibronectin expression and cell prolixferationJ.Fertil Streil,2000,73(5)：1006.3胡舒勤，郑红兵.桂枝茯苓胶囊对实验性子宫肌瘤中孕激素和胰岛素样生长因子I的影响J.湖北中医杂志，2005，27（4）：6.4李冬华.子宫肌瘤大鼠模型制备方法之比较J.中国现代医学杂志，2005，15（24）：3700.5白会敏，王惠兰，陈素琴. 转化生长因子1，3及其受体R，R，mRNA及蛋白在子宫肌瘤组织中的表达J.河北医科大学学报，2003