镉对大鼠输精管损伤及锌保护的超微结构与葡萄糖-6-磷酸酶细胞化学的研究

1、    镉对大鼠输精管损伤及锌保护的超微结构与葡萄糖-6-磷酸酶细胞化学的研究罗子国李维信 【摘要】目的研究小剂量氯化镉对大鼠输精管近、远段的影响及锌的保护作用。方法用1%氯化镉(2mg/kg 体重)腹腔注射雄性Wistar大鼠后4h到60d及镉、锌联合注射后3d、15d取材。采用电镜观察和葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)电镜细胞化学定量研究。结果镉注射4h后，输精管主细胞出现超微结构改变，37d改变最明显，15d后有所减轻，60d后基本恢复正常。主细胞的主要改变为线粒体肿胀，内质网扩张及髓样结构增多。镉注射后4h，远段主细胞G-6-Pase反应产

2、物明显减少，3d最少，15d反应产物增多。镉、锌联合注射后超微结构及G-6-Pase活性损伤均较单纯镉组轻。结论锌对镉所致大鼠输精管主细胞超微结构损伤及远段主细胞G-6-Pase活性影响有明显保护作用。 【关键词】镉锌输精管超微结构葡萄糖-6-磷酸酶大鼠 THE INJURIOUS EFFECTS OF CADMIUM AND PROTECTION OF ZINC ON ULTRASTRUCTURE AND CYTOCHEMISTRY OF G-6-Pase OF VAS DEFERENS IN RATS Luo Ziguo， Li Weixin (Laboratory of Electron

3、 Microscopy, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing) 【Abstract】 Objective To study the injurious effects of small dose CdCl2 and protection of zinc on proximal segment and distal segment of vas deferens in rats. MethodsThe rats were treated with CdCl2(2mg/kg body weight) and Cd+Zn. The

4、specimens were investigated by transmission electron microscopy and quantitative analysis of the changes of the cytochemical reactive product of G-6-Pase from 4 hours to 60 days after treatment. ResultsThe ultrastructural changes of principal cells were detected after 4 hours of Cd treatment. The de

5、generation became most prominent within 3-7 days, but tended towards recovery after 15 days and nearly normal appearance on 60 days after Cd treatment. The main alterations in principal cells were dilatation of endoplasmic reticulum (ER), swelling of mitochondria and increasing of myelin figures. G-

6、6-Pase reactive product of principal cells of distal segment decreased 4 hours after Cd treatment, became most prominent after 3 days, tended to increase after 15 days. The protective effects of zinc on Cd induced injuries in ultrastructure of principal cells and G-6-Pase reactive product of distal

7、segment principal cells from vas deferens were prominent in rats. ConclusionCadmium had injurious effects on the ultrastructure and G-6-Pase activity in principal cells of vas deferens. Zinc had prominent protective effects to the injuries of cadmium. 【Key words】 Cadmium; Zinc; Vas deferens; Ultrast

8、ructure; G-6-Pase; Rat 镉是一种半衰期很长，可致肝、肾等多器官损害的蓄积性有毒重金属，对人的生殖功能具有潜在性危害1。我们已报道小剂量氯化镉(2mg/kg体重)可致大鼠睾丸生精细胞、间质细胞及附睾和精囊腺上皮细胞迅速出现超微结构损伤，且持续时间较长24。输精管不仅是排精通道，其上皮还有合成、分泌与吸收等功能，它的分化、发生及发育均依赖于雄激素5。1963年，Gunn等6曾报道0.03mmol/(Lkg)体重氯化镉皮下注射后，光镜下大鼠输精管结构无改变。有关镉对输精管损伤及锌保护作用研究则尚未见报道。本研究从超微结构和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphat

9、ase, G-6-Pase)细胞化学两方面探讨小剂量氯化镉对大鼠输精管近段与远段的影响及锌的保护作用，及其作用机理。 材料和方法 1动物分组 成年雄性Wistar大鼠36只，体重190250g，分单纯镉组、镉加锌组及对照组，单纯镉组21只，镉加锌组6只，对照组9只。单纯镉组腹腔内1次注射0.1%氯化镉(2mg/kg体重)，分别于4h及1、3、7、15、30、60d后取材。镉加锌组分3次腹腔内注射，先注射1%醋酸锌15mg/kg体重，2h后注射氯化镉2mg/kg体重和醋酸锌50mg/kg体重，再隔2h注射醋酸锌15mg/kg体重，醋酸锌总剂量为80mg/kg体重，分别于3d及15d后取材。对照组

10、腹腔内注射等体积生理盐水。 2. 取材及电镜样品制备 取左侧输精管近段及远段7，即近段距附睾尾0.5cm，远段距前列腺1.0cm，纵向切开成为两等份，用磷酸盐缓冲液配制的4%戊二醛及1%四氧化锇作固定和后固定(pH7.27.4)，酒精及丙酮逐级脱水，环氧树指618浸透作定向包埋。先作0.5 m厚横断面半薄切片，经1%次甲基蓝-天青染色，光镜下定位后，再作超薄切片。经醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，H-600型透射电镜观察。 3. G-6-Pase电镜细胞化学样品制备 材料取自动物右侧输精管远段，包括单纯镉4h及3、15d组及镉加锌3、15d组和对照组。用经提纯的2.5%戊二醛预固定1h，以改进的Te

11、utsch法配制孵育液，底物为葡萄糖-6-磷酸钠，捕获剂系硝酸铅8，37孵育1h；对照孵育液内去除底物葡萄糖-6-磷酸钠。1%四氯化锇后固定，再转入常规电镜样品制备，超薄切片不经铅染色，电镜下观察。 4. 输精管远段主细胞G-6-Pase电镜细胞化学定量分析 电镜下恒定放大15 000倍，每组随机拍摄胞质10张，共60张底片。运用Tecbisa-6803真彩色医学图像分析系统对所得照片上酶反应产物总面积与背景面积比值(TABA)进行测量。所有测量数据均以平均值±标准差表示(±s)，结果经统计学处理，采用方差分析，并作多组比较。运用美国SAS软件，微机自动处理结果。 结果 1

12、. 正常大鼠输精管上皮超微结构 1.1 近段：为假复层柱状上皮，由主细胞和基细胞组成。主细胞游离面微绒毛细长而密集，微绒毛之间可见有衣小凹，较多的有衣小泡和多泡小体位于顶端质膜下。核呈卵圆形，常染色质较多，核下区和核周含有较丰富的粗面内质网，腔内有低电子密度物质，顶部胞质内有较多呈管泡状的滑面内质网。较发达的高尔基复合体位于核上区，线粒体散在，未见有分泌颗粒。基细胞含较少的细胞器。 1.2 远段：远段主细胞微绒毛较近段粗短且较少；有些主细胞可见顶端表面隆起，部分脱落入管腔，其内含有丰富的滑面内质网和少量线粒体，少数脱落入管腔的小体内部胞质已崩解。核外形较不规则。远段主细胞的主要特征是含有很丰富

13、的滑面内质网，在核周和核下区成层紧密排列呈涡旋状(图1，2)。部分主细胞顶部含有较丰富的线粒体。少数主细胞内见有被吞噬精子的断面。 2. 镉对大鼠输精管主细胞超微结构的影响 镉注射后4h，近段上皮主细胞间隙扩大，胞质内和微绒毛区髓样结构增多，线粒体轻度肿胀。远段主细胞除线粒体内室轻度肿胀外，一部分线粒体内出现髓样结构，但滑面内质网形态正常。1d组，近段的以上改变进一步加重；远段主细胞丰富的滑面内质网呈局部轻度扩张。37d，近段上皮主细胞线粒体广泛内室肿胀、空化，粗面内质网及高尔基复合体扩张。可见有些主细胞胞质内出现大泡，核异染色质边集，微绒毛减少及局部胞质崩解。远段主细胞的核异染色质边集，核周

14、间隙扩大，滑面内质网明显扩张，排列紊乱，改变较轻的尚可识别其涡旋状，改变重者则见有膜断裂及相互融合呈较大的腔隙(图3，4)。15d和30d组，近段仅见少数主细胞粗面内质网轻度扩张，线粒体轻度肿胀，溶酶体明显增多。15d组的远段仍见部分滑面内质网显著扩张，核异染色质边集。30d组远段的上述改变进一步减轻，但滑面内质网数量较少。60d组的近、远段主细胞超微结构均基本恢复正常。 3. 锌对镉所致大鼠输精管主细胞损伤的保护 锌保护3d组与单纯镉3d组比较，近段除仅见个别主细胞粗面内质网轻度扩张外，远段见部分主细胞滑面内质网轻度扩张(图5)。15d组近段主细胞形态基本正常，无明显超微结构改变；远段少数主

15、细胞滑面内质网轻度扩张，大部分主细胞滑面内质网形态正常。 4. 远段主细胞G-6-Pase酶活性图像分析 正常大鼠输精管远段主细胞含丰富的滑面内质网，G-6-Pase是内质网的标志酶之一，其反应产物呈高电子密度细小颗粒，沿内质网膜和核被膜呈均匀分布(图6)。镉注射4h后，内质网膜上G-6-Pase反应产物分布较对照组稀疏且不均匀。3d后，酶反应产物明显减少，呈零星分布且颗粒大小不均匀(图7)。15d组，在部分内质网酶反应产物较3d组有明显增多，仍较对照组少。锌保护3d及15d组G-6-Pase反应产物较相应阶段单纯镉组均有明显增加(图8)。 图像分析结果经统计学处理表明，镉注射后4h及3、15

16、d，酶反应产物与背景面积之比(TABA)与对照组比较有显著差异(P0.05),其中4h组，15d组与3d组的TABA值又有显著性差异(P0.05)，而4h组15d组之间无显著性差异(P0.05)。锌保护3d组和15d组与相应阶段单纯镉组TABA值有显著性差异(P0.05)，其中15d保护组与3d保护组之间也存在显著性差异(P0.05)，且两者均与对照组有显著差异(P0.05)。结果见附表。 附表葡萄糖-6-磷酸酶反应产物图像分析TABA(±s) Table Image analysis of G-6-Pase reaction product TABA (±s) 组别 gr

17、oup 给药后时间 (time after treatment) 4h 3d 15d 镉 (Cd) 0.20343±0.021a,b,d 0.12494±0.443a,c,d 0.17693±0.0139a,b,d 镉+锌 Cd+Zn 0.17883±0.128a,b,d 0.24921±0.024a,b,c 对照 control 0.36677±0.055 注：a.与对照组比较P0.05，b.与单纯镉3d组比较P0.05，c.与单纯镉4h、15d及Cd+Zn 3d比较P0.05，d.与Cd+Zn 15d比较P0.05 Note:a：

18、 compared with control, P0.05，b： compared with 3d after Cd, P0.05，c： compared with 4h、15d after Cd and 3d after Cd+Zn,P0.05，d： compared with 15d after Cd+Zn, P0.05 讨论 正常大鼠输精管上皮超微结构有明显的区域性变化7。本实验观察结果也表明近、远段上皮超微结构的差别主要表现于主细胞。近段主细胞含有丰富的粗面内质网和发达的高尔基复合体，是合成蛋白质和糖蛋白的超微结构基础。远段主细胞滑面内质网很丰富，具有类固醇合成的超微结构特征，文献报道

19、体外实验早已证实大鼠输精管远段主细胞能利用乙酸盐合成胆固醇和睾酮，只是其速率较附睾低9，10。大鼠远段主细胞顶端表面的隆起结构，提示可能与牛及小鼠相似，是以顶浆分泌方式将合成物分泌到管腔11。本实验所见远段主细胞内含有精子断面，说明远段主细胞具有吞噬精子的功能，Cooper等12曾有相似结果报道，其意义尚待进一步研究。输精管上皮主细胞微绒毛丰富，质膜下有大量有衣小泡等与吸收功能有关的结构，其吸收功能也已通过透射电镜和酶细胞化学所证实13。 Gunn等6用0.015mol/(Lkg)体重CdCl2皮下注射后光镜观察认为大鼠输精管无形态学改变。还有文献报道小剂量CdCl2(2mg/kg体重)可选择

20、性损伤睾丸，但不引起其他器官改变1。李维信等24的研究则证实该剂量可致睾丸、附睾及精囊腺超微结构损伤及AlPase和TPPase细胞化学改变，且血清睾酮水平呈现下降。本研究则探讨2mg/kg体重CdCl2对大鼠输精管上皮损伤及锌保护作用的超微结构改变，同时用G-6-Pase细胞化学方法分析远段上皮主细胞功能变化。结果表明：2mg/kg体重CdCl2腹腔内注射后4h，输精管近段上皮间隙扩大，出现髓样结构，1d后改变加重，3、7d近段主细胞可见崩解甚至脱落，远段滑面内质网显著扩张，排列紊乱，改变重的见有膜断裂及腔相互融合，15、30d主细胞肿胀溶解性改变有所减轻，仅见少数主细胞轻度肿胀，但细胞内溶

21、酶体数量增多，远段主细胞伴有滑面内质网数量减少。60d后基本恢复正常。 自1957年，Parizek14首先报道镉对哺乳动物睾丸的形态学影响以来，有关镉对睾丸损伤的研究较多。我们和其他学者的一些研究揭示了镉对睾丸及附属性腺损害与脂质过氧化物作用有关。它通过抑制超氧化物歧化酶(SOD)活性，使活性中间氧化水平升高，间接诱发细胞膜脂质过氧化。有人认为游离的镉离子能抑制细胞膜蛋白质和脂类的相互关系，并使蛋白质变性，抑制定位于膜上的磷脂合成酶系，最终使膜的类脂构成改变和细胞损伤。本研究结果表明镉所致输精管早期超微结构损伤为肿胀溶解性改变，与我们在睾丸、附睾及精囊腺所见相似，故支持镉能直接损伤生物膜的观

22、点。阉割大鼠后的输精管退变时间出现较晚5，徐晨等4报道2mg/kg体重CdCl2注射后1h，血清睾酮浓度开始下降，7d达到基线水平，30d开始回升，60d接近正常水平。此结果与本研究超微结构变化在时间上基本相符。说明血清睾酮水平的变化与输精管上皮的退变与恢复有关。 G-6-Pase具有水解酶活性，是糖代谢的关键酶之一，一般认为在肝细胞活性较强，而在其他脏器活性较弱。本研究表明正常大鼠输精管远段主细胞该酶活性较高，镉注射后4h其反应产物明显减少，3d后反应产物仍稀疏，分布不均匀，15d后已有恢复，但仍低于正常水平。G-6-Pase细胞化学改变与相应阶段主细胞超微结构改变程度基本相符。鉴于G-6-

23、Pase是内质网的标志酶之一，镉所致该酶反应产物的减少，可提示与滑面内质网损伤有关，但该酶反应产物的减少在时间上早于内质网改变，故也提示镉可能直接损伤该酶活性。 锌是维持哺乳动物生殖器官功能的重要微量元素。许多研究报告指出锌对镉所致生殖系统损伤有良好的保护作用2，3，14。本研究结果表明，锌对镉所致输精管超微结构损伤及远段上皮G-6-Pase活性均有显著保护作用。其保护机理可能与通过诱导金属硫蛋白(MT)的产生，以更多的Cd-MT结合形式贮存于胞质内，以及锌直接与镉竞争主要大分子上的高亲和位点，从而减少镉的直接损伤有关15。此外，锌对镉所致睾丸间质细胞损伤也有保护作用2，这对于依赖于雄激素的输

24、精管，也会有间接保护作用。 图版说明 图1正常大鼠输精管远段主细胞。示管腔(Lu)、主细胞核(N)、滑面内质网(SER)、基膜、多泡小体×2 500 图2正常大鼠输精管远段主细胞内滑面内质网呈涡旋状排列(SER)×2 500 图3镉注射后3d，远段主细胞核周间隙扩大()，滑面内质网(SER)明显扩张×5 200 图4镉注射后3d，远段主细胞内滑面内质网(SER)明显扩张放大×25 000 图5镉锌联合注射后3d，远段主细胞滑面内质网(SER)仅有轻度扩张×25 000 图6正常大鼠输精管远段主细胞内G-6-Pase反应产物较多×15

25、000 图7镉注射后3d，远段主细胞内G-6-Pase反应产物减少×15 000 图8镉锌联合注射后3d，远段主细胞内G-6-Pase反应产物增多×15 000 Fig.1 Principal cells of distal segment of vas deferens from normal rats. N, nuclei; SER, smooth endoplasmic reticulum; BM, basal membrane; Mb, multivescular body; Lu, lumen. ×2 500 Fig.2 Smooth endoplasm

26、ic reticulum(SER) appear whorl from principal cells of distal segment of vas deferens in normal rat. ×25 000 Fig.3 Dilation of perinuclear cisterna() and SER dilation prominent of principal cell from distal segment 3 days after Cd treatment. ×5 200 Fig.4 Showing magnification of dilation p

27、rominent of SER in distal segmental principal cells 3 days after Cd treatment. ×25 000 Fig.5 Showing magnification of slight changes of SER of distal segment 3 days after Cd add Zn treatment. ×25 000 Fig.6 showing more G-6-Pase reactive product of distal segmental principal cell in normal

28、rat. ×15 000 Fig.7 G-6-Pase reactive product decrease of principal cell from distal segment 3 days after Cd treatment. ×15 000 Fig.8 G-6-Pase reactive product increase of principal cell from distal segment 3 days after Cd add Zn treatment. ×15 000 Laboratory of Electron Microscopy, Ch

29、ongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400046,China 作者单位：罗子国李维信(重庆医科大学电镜室，生殖医学超微结构实验室， 重庆400046) 参考文献 1Fowler AJ, Singh DN, Dwivedi C. Effect of cadmium on meiosis. Bull Environm Contam Toxicol, 1982， 29(4)：412 2李维信，廖晓岗，唐宜，等.镉对大鼠睾丸的损伤及锌保护作用的超微结构研究.解剖学报，1988，19(1)：74 3廖晓岗，李维信.镉对大鼠附睾的损伤及锌和维

30、生素E的保护作用.解剖学报，1997，28(3)：215 4徐晨，李维信.镉对大鼠精囊腺超微结构及TPPase细胞化学和血清睾酮含量的影响.解剖学报，1997，28(3)：209 5Rodriguez A, Bustos-Obregon E. Histophysiological and morphometric studies of the post natal development of rat vas deferens. Andrologia, 1993, 25(1):29 6Gunn SA, Gould TC, Anderson WAD. The selective injuriou

31、s response of testicular and epididymal blood vessels to cadmium and its prevention by zinc. Am J Pathol, 1963；42(6)：685 7Flickinger GJ. Regional variations in endoplasmic reticulum in the vas deferens of normal and vasectomized rats. Anat Rec, 1973， 176(2)：205 8Teutsch HF. Improved method for the histochemical demonstration of glucose-6-phosphatase activity. Histochemistry, 1978, 57(2):107 9Gunn SA, Gould TC. Vasculature of the testis and adnexa. In