中华血液学杂志

1、论著不同冻存保护剂对脐血造血细胞生物学特性的影响陈汝光朱美玲黄玲惠刘永梅奚永志【摘要】目的探索有效低温保存脐血造血细胞的冻存保护剂。方法对比4种不同的联合低温保护剂对脐血有核细胞(T NC 的保护作用, 并在冻存后1,2,3及4个月分别检测其复苏后脐血C D 34+细胞及集落形成细胞(CFC 数。结果4种不同联合的低温保护剂对脐血T NC 、C D 34+细胞及CFC 的保护作用差别显著, 依次为右旋糖酐240(Dextran 240 +二甲基亚砜(DMS O >生理盐水+DMS O >DMS O +自体血清>DMS O +体积分数为6%AB血清+50g/L 羟乙基淀粉(DM

2、S O 的体积分数均为10% ;Dextran 240+DMS O 的保护效果最佳, 能使复苏后脐血的T NC 、C D 34+细胞和CFC 分别达77. 8%、78. 5%和87. 2%。结论Dextran 240+DMS O 是一种理想的脐血造血细胞低温保存剂。【关键词】造血细胞, 胎血; 血液保存E ffects of different cryoprotectants on biological properties from cord blood CHEN Ruguang 3, ZH U Meiling , H UANG 3and Cord Blood Bank , Shenzhen

3、518101, China【Abstract 】Objective T oprotectants that can be used in cord blood bank to cry op 2reserve hematopoietic of combined reagents were used to cry opreserve cord blood cells. The effects of these cry biological properties of hematopoietic cells were m onitored and compared after the cells w

4、ere refrigerated for 1to 4m onths. The detected biological properties included the number of total nucleat 2ed cells (T NC , C D 34+cells and CFCs. R esults The cry oprotectants of Dextran 240+10%DMSO resulted in the highest recovery rates , T NC , C D 34+cells and CFCs were 77. 8%, 78. 5%and 87. 2%

5、, respectively. The combi 2nation of 10%DMSO +6%AB serum +5%HESled to the lowest recovery rates. Conclusion Dextran 240+10%DMSO is an ideal cry oprotectant combination for cry opreserving hematopoietic cells in the cord blood bank. 【K ey w ords 】Hematopoietic cells ,cord blood ; Cry opreservation由于脐

6、血造血细胞低温保存效果的优劣直接影响着脐血造血细胞的数量和质量, 成为决定移植后成功与否的重要因素之一。我们较系统地评价了4种联合低温保护剂对脐血造血细胞的保护效果。材料和方法1材料所有脐血均来源于深圳宝安区西乡人民医院妇产科。二甲基亚砜(DMS O 购自Sigma 公司,羟乙基淀粉(HES 购自Dupont 公司, 右旋糖酐240(Dextran 240 购自Baxter 公司, 抗人C D 342FITC 购自Calbiochem 公司, 克隆形成细胞(CFC 甲基纤维素培养基购自Stem cell 公司。作者单位:518101深圳市宝安区中心血站、深圳宝安脐血库(陈汝光、朱美玲、刘永梅

7、; 深圳宝安区西乡人民医院(黄玲惠 ; 军事医学科学院附属医院免疫学研究室(奚永志2方法2. 1脐血造血细胞的分离:HES分离法无菌分离每份脐血有核细胞, 使其终体积缩减到20ml 左右。2. 2脐血总有核细胞(T NC 计数:采用H3血细胞计数仪计数冻存前后的脐血T NC 数量。2. 3C D 34+细胞计数:分别取50l 冻存前后的T NC , 加入抗人C D 342FITC 单抗充分混匀, 于4避光孵育30min , 用生理盐水洗涤3次, 立刻在荧光显微镜下计数500个有核细胞, 计算C D 34+细胞比例, 每份标本计数2次, 取其均值。C D 34+细胞数=T NC ×C

8、D 34+细胞在T NC 中所占比例×体积分数。2. 4CFC 培养:分别取冻存前及冻存1,2,3,4个月的T NC 加入1ml 甲基纤维素培养基中, 其中含有50ng/ml 重组人干细胞刺激因子(rhSCF 、10ng/ml 重组人粒2巨噬细胞集落刺激因子(rhG M 2CSF 、10ng/ml 重组人白细胞介素3(rhI L 23 及3U/ml 重组人红214 细胞生成素(rhE po , 充分混匀后加入24孔培养板内, 置37、体积分数为5%的C O 2、全饱和湿度的培养箱中进行培养, 第14天计数总CFC 。2. 5低温冷冻:将脐血分装在低温无菌冷冻管中, 分别加入4种不同联

9、合的低温保护剂:方法为体积分数10%DMSO +体积分数6%的AB 血清+50g/L HES ; 方法为体积分数10%的DMS O +自体血清; 方法为生理盐水+体积分数10%的DMS O ; 方法为Dextran 240+体积分数10%的DMS O , 混匀后置液氮深低温冻存。3统计学分析进行区组设计的方差分析, 以时间为区组, 不同的低温保护剂为处理组。结果1不同的低温保护剂对冻存后T NC 的影响4种不同组合的低温保护剂对脐血T NC 复苏率的影响差异有显著性, 方差分析, F =196. 9, P <0. 01, 保存效果尤以Dextran 240+DMS O 为最佳, 护剂冻存

10、不同时间T NC (1 。表1(%, x ±s 冻存方法样本数(月1234方法1058. 3±2. 853. 7±3. 158. 7±2. 755. 1±2. 9方法1069. 2±3. 165. 2±3. 467. 8±2. 965. 6±3. 3方法1071. 9±3. 468. 8±3. 567. 9±3. 367. 5±3. 4方法1079. 1±3. 277. 6±3. 577. 9±3. 478. 5±3. 32不

11、同的低温保护剂对冻存后脐血C D 34+细胞的影响比较4种低温保存剂对复苏后C D 34+细胞的数量影响, 差异有显著性, 方差分析F =259. 2, P <0. 01。根据复苏后C D 34+细胞的数量,Dextran 240+DMS O 保存C D 34+细胞的效果最好。同一种低温保存剂在4个月保存期内对C D 34+细胞复苏率的影响差异无显著性(表2 。表2不同冻存条件对脐血C D 34+细胞复苏率的影响(%, x ±s 保存方法样本数冻存时间(月1234方法1047. 9±3. 050. 1±2. 749. 8±2. 649. 1

12、7;2. 7方法1070. 2±3. 168. 9±3. 570. 1±3. 270. 3±3. 3方法1072. 4±3. 069. 8±3. 469. 7±3. 369. 2±3. 1方法1081. 4±3. 278. 9±3. 375. 6±3. 678. 0±3. 03不同的低温保护剂对冻存后脐血CFC 的影响比较4种不同的低温保存剂对复苏后脐血CFC 的影响, 结果差异有显著性, 经统计分析, F =718. 6,P <0. 01。根据CFC 数, 采用Dex

13、tran 240+DMS O 对CFC 保护效果最好。同一保存剂在4个月内对CFC 保存不同时间的保护效果差异无显著性(表3 。表3不同冻存条件对脐血CFC 复苏率的影响(%, x ±s 冻存方法样本数冻存时间(月1234方法1051. 4±2. 952. 9±3. 051. 0±3. 250. 9±3. 5方法1074. 2±3. 073. 1±2. 974. 8±2. 974. 6±3. 1方法1076. 1±3. 575. 4±3. 776. 1±3. 672. 9&#

14、177;4. 1方法1089. 0±3. 386. 2±3. 687. 8±3. 486. 4±3. 4讨论脐血T NC 的平均含量约为1. 5×109/L , 只相当T NC 的1/101。这就。深低温冻存脐血所O 为主, 由于DMS O 可与细胞中的, 常可导致细胞破坏死亡, 因此如何配制联合低温保护剂, 既充分发挥DMS O 低温保护细胞的效应, 又能有效降低其细胞毒作用是目前探索脐血造血细胞有效低温保存的主题2,3。冻存复苏后脐血T NC 、C D 34+细胞和CFC 数量3项指标显示,4种联合低温保存剂中以Dextran 240+DM

15、S O 的效果最佳, 它可使T NC 、C D 34+细胞和CFC 平均复苏率分别达77. 8%、78. 5%和87. 2%, 说明该联合保存剂保存脐血造血细胞能获得较理想的保存效果。实验中我们还发现, 采用上述4种联合低温保护剂也可在-80低温冰箱中保存脐血造血细胞, 保存期4个月内对T NC 、C D 34+造血细胞和CFC 复苏率无明显不良影响。参考文献1H ows JM , Bradley BA , M arsh JCW , et al. G rowth of human umbilical 2cord blood in long term haem opoietic cultures. Lancet , 1992,340:73275. 2朱为国, 邢献