慢病毒包装操作方案

1、慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mMInvitrogenDMSO（冻存用）10%2 慢病毒包装试剂试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000InvitrogenOpti-MEM基础培养基InvitrogenPEG6000溶液50%WakoNaCl溶液40 mMHBSS溶液Invitrogen3 耗材l 50 mL离心管l 15 mL离心管l 10 cm细胞培养皿l 0.45m过滤器l 2 mL EP管二、操作流程1 细胞培养

2、1.1 293T/293FT细胞的复苏1) 将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。在超净台内，用吸管吸取67mL完全培养液至15 mL离心管中；2) 快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在12分钟内完全融化；3) 在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。4) 在室温条件下，250 g离心4分钟。5) 离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管

3、吸取 2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置 37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。）6) 复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。1.2 293T/293FT细胞传代1) 待细胞长至60%-70%融合度即可传代。将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2) 加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵

4、育1-2分钟。在显微镜下观察，可看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间；3) 加入等体积完全培养液终止消化，并用吸管吹打培养瓶底2-3次使所有细胞彻底脱壁。用吸管转移细胞悬浮液到15 mL 离心管中，用吸管吸取2-3 mL的PBS将残余细胞冲洗下来，一并加到15mL离心管中，混匀吹打10次使细胞分散；4) 在室温条件下，250g离心4分钟。离心后，倒去上清，用2 mL完全培养液重悬细胞，取样计数；5) 根据计数结果，按照 2×1045×104/cm2的细胞密度接种细胞；写上细胞名称、日期，放置

5、37°C、 5% CO2饱和湿度培养箱内培养。注1：T75培养瓶建议293FT细胞接种1.8×106；293T 接种2.0×106细胞量。注2：293T细胞生长达70%-80%融合度即可传代；293FT细胞生长达到60%融合度即可传代，不可生长过密；1.3 293T/293FT细胞冻存1) 待细胞长至 70%-80%融合度即可传代。消化过程可参照1.2相关步骤。2) 消化后，取样待计数。计数同时，将细胞于室温条件下，250g离心4分钟。3) 离心后，倒去上清（上清需吸取干净），根据计数结果，按1.5-2×106细胞量/mL的密度，用冻存液进行重悬，并将悬

6、液平均分至事先做好标示的冻存管中，旋紧盖子，按所使用的冻存仪器操作步骤进行冻存。注：冻存管标示内容包括：细胞名称，细胞代次，以及冻存批号（批号标示：时间+人员代码+批次流水号）。2 慢病毒包装2.1 慢病毒包装前的准备工作1) 包装培养皿的处理病毒包装前的细胞需要接种在有明胶包被的培养皿上。接种细胞前，吸取0.1%明胶加至培养皿中，能完全覆盖表面即可，室温静置包被30分钟。30分钟后吸走明胶，使其晾干液体即可。2) 准备293FT/293T细胞。细胞的生长状态影响病毒的生产。应使用复苏后传代培养至少两代的细胞包装慢病毒，但不能使用超过10代的细胞。将细胞传到包被了明胶的直径10 cm培养皿中。

7、2.2 慢病毒包装过程（脂质体转染法）1） 转染前一天，接种293T细胞到一个直径10 cm培养皿中，接种细胞数量应以转染当天的细胞生长达到90%95%融合为佳（一个直径10 cm培养皿，如在上午接种4.8×106个细胞，下午接种5.0×106个细胞为宜；加10 mL含丙酮酸钠的血清培养基）；2） 转染当天，观察细胞能否包装病毒。主要观察的指标是：细胞是否接种均匀，细胞的融合程度是否达到 90%95%。若细胞的状态合适，则从细胞中去除培养液，加入5 mL病毒包装用培养液，为了避免细胞脱壁，培养液应沿培养皿壁缓慢加入。注：包装培养基不能含有抗生素，而且在每次使用前，培养基应3

8、7°C、5% CO2培养箱中平衡pH值。3） 准备 DNA-Lipofectamine2000复合物，以一个直径10 cm培养皿的用量为示范：A. 准备一支无菌的5 mL离心管加入1.5 mL无血清Opti-MEM培养液、辅助质粒和慢病毒表达质粒，充分颠倒混匀；注： 表达质粒用量(g) =质粒大小(kb)×1.27；无血清Opti-MEM培养液需预热至37°C。B. 准备另外一支无菌的5 mL离心管里，加入1.5 mL无血清Opti-MEM培养液和68L的Lipofectamine2000，轻轻颠倒混匀，室温孵育30分钟；C. 30分钟后，把含有质粒DNA的无血清

9、Opti-MEM培养液加入到含Lipofectamine2000的无血清Opti-MEM培养液，轻轻颠倒混匀，室温孵育 30 分钟；D. 30分钟后，DNA- Lipofectamine2000 复合物形成；溶液有可能变混浊，但是不会影响转染效果。4） 把 DNA- Lipofectamine2000 复合物一滴一滴地添加到293T细胞中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物。放置 37°C、5% CO2 饱和湿度培养箱中培养。转染后的 4-6 小时内每隔 30 分钟需观察细胞毒性反应，当出现可观察的毒性反应时，应立即吸除原培养液，加入8 mL病毒包装用培养液，放置 37°C、

10、5% CO2 饱和湿度培养箱中继续培养。2.3 慢病毒收集和浓缩（PEG浓缩法）1) 转染后48小时，收集含有病毒的培养液。把培养液吸到一支无菌的有盖 50 mL 离心管中，再补加8 mL 病毒包装用培养液至还能产毒的细胞中；2) 4°C、3000 rpm离心15分钟，低速离心病毒上清，去除细胞碎片，回收上清；3) 转染后 72 小时，收集含有病毒的培养液。4°C、3000 rpm离心15分钟，低速离心病毒上清，去除细胞碎片，回收上清。将48小时收集的病毒上清液和72小时收集的病毒上清液，用0.45m的小滤器过滤，用50 mL离心管收集滤液；4) 根据滤液体积加入对应量的50% PEG6000和40 mM NaCl溶液。充分均匀混合液，静置于4°C沉淀过夜（X mL病毒滤液加入0.2073X mL的50% PEG6000和0.012195X mL的40 mM NaCl）。5) 次日取出浓缩管，4°C、1500g离心30分钟后倒掉上清，再进行4°C、1500g缓慢加速，