基因表达分析技术

1、2022-2-21 医学分子遗传学医学分子遗传学 第四章分子遗传技术方法第四章分子遗传技术方法 基因表达分析技术基因表达分析技术METHODS FOR ANALYZING GENE EXPRESSIONSpeaker：Gene Expression2022-2-222022-2-23实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)是荧光化学物质与PCR产物相结合，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。在线实时监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看

2、到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控，精确定量 结果分析更快捷方便，无需电泳 2022-2-26荧光染料荧光染料 SYBR Green I 是一种结合于双链DNA（double-strand,dsDNA） 小沟中的荧光染料，游离的荧光染料不发出信号，所以开始时检测不到荧光信号，随着扩增的进行，染料不断地与dsDNA结合而发出荧光，被荧光探测系统检测到。2022-2-27非特异性荧光染料标记：非特异性荧光染料标记：SYBR Green I SYBR Green I 特异性荧光标记：特异性荧光标记：TaqM

3、anTaqMan优点优点与特异性的荧光探针相比价格便宜 只需要设计PCR引物荧光信号强与其它探针相比设计简单可用于多通道检测 可用于SNP的检测缺点缺点由于它和模板的结合是非特异性的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产物结合，不能真实反映目 的基因的扩增情况比DNA结合染料价格高2022-2-28Ct（ threshold value ）值是指荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数，此时荧光信号明显高于背景荧光信号。2022-2-29CtCt值与模板起始浓度的关系值与模板起始浓度的关系 模板起始浓度越高，Ct值越小 Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系 如果模板浓度增加1倍，C

4、t值就提前1个循环到达 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达2022-2-210相对定量（Relative quantification）是计算要处理样本相对于正常（内参基因）样本的基因表达量变化，属于倍数关系式，扩增效率达到100%时用2 -CT 法来分析处理实验数据。实验过程中还要引入一个或多个内参基因进行校正和标准化。内参基因（Reference gene）是指在不同类型细胞、不同实验处理条件下恒定表达的一类管家基因，常用的内参基因有b-actin、GAPDH、18sRNA、efla等。相对定量分析方法1 2 -Ct前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏差在5以内。1

5、计算计算CtCt：Ct=Ct Ct=Ct 靶基因靶基因Ct GAPDHCt GAPDH，分别计算实验组，分别计算实验组和对照组的和对照组的CtCt。2 2计算计算CtCt：Ct=CtCt=Ct实验组实验组CtCt对照对照组组。3 3计算相对表达量的差值。计算相对表达量的差值。2 2 Ct Ct 靶基因靶基因A AGAPDHGAPDHCtCt对照组对照组实验组实验组相对定量分析方法2：双标准曲线法前提：目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度2022-2-213二二、基因表达分析的具体步骤、基因表达分析的具体步骤

6、1、提取、提取RNA,并鉴定所提并鉴定所提RNA的完整性（的完整性（0.8%的的琼脂糖凝胶电泳）和纯度（紫外分光光度计（）和纯度（紫外分光光度计（2.0-2.2）。）。2022-2-2142、反转录2022-2-215（1）、NCBI 官网 gene bank 查找xx基因cDNA序列，根据cDNA序列设计RT-qPCR引物，产物长度80-150bp最佳。引物由primer 5软件设计，正反引物的Tm 值相差小于2，GC%比小于3。（2）、设计好的引物再通过NCBI blast 引物比对官网进行初步筛选，并将设计好的引物交由相关基因公司（如华大基因）合成。（3）、新合成的引物以cDNA 为模板

7、，添加gene star PCR mix 进行预实验，设计多个实验重复，ABI梯度PCR仪上进行梯度PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳，marker 比对结果判定产物大小及引物退火温度的最佳条件。（4）、将ABI 梯度PCR 仪在最佳退火条件下扩增的PCR产物交由相关基因公司（如华大基因）进行普通测序，用于判断测序结果与目标片段是否吻合，引物位置与初始引物设计位置是否相同。3、设计引物2022-2-216根据实验样品类型及条件，选取相关基因（如GAPDH 、?-actin等）为备选内参基因，geNorm 软件分析备选内参在实验样本中的稳定性，以M1.5为最佳内参。2022-2-217根据绝对定

8、量PCR原理，对cDNA进行5个数量级的10倍梯度稀释，利用各个浓度的cDNA进行绝对定量以获得相关基因的扩增效率。2022-2-218每个样本基因的PCR反应设置3个平行重复以保证实验结果的准确性，数据处理采用均值计算。反应体系反应体系体积体积SYBR Green I Master Mix10ulForward Primer(10umol/L)1ulReverse Primer(10umol/L)1ulcDNA 模板1ulRnase ddH2O7ul总体积20ul6、实时荧光定量PCR2022-2-219PCR均采用10 min预变性，彻底打开聚合酶活性。为了提高PCR扩增效率，采用变性及退火进行扩增40个循环。扩增结束后在相应的温度和时间中进行变性和退火后开始“溶解曲线程