第十七章色谱分析法概论2ppt课件

1、第十七章第十七章 色谱分析法概论色谱分析法概论 chromatography分析化学教研室分析化学教研室 李发美教授李发美教授 色谱法的分类和开展 色谱过程和根本原理 根本类型色谱方法及其分别机制 色谱法根本实际高分别效能、高灵敏度、高选择性、分析速度快、运用范围广色谱法的特点:色谱学的重要作用诺贝尔化学奖：1948年，瑞典Tiselins，电泳 和 吸 附 分 析 ； 1 9 5 2 年 ， 英 国 马 丁(Martin)和辛格(Synge)，分配色谱。运用的科学领域：生命科学、资料科学、环境科学等。科学的科学药学药物分析：各国药典收载了许多色谱分析方法。中国药典二部，700多，纯度检查、定

2、性鉴别或含量测定，一部，600多鉴别或含量测定。 第一节 色谱法的分类和开展一、色谱法的分类按流动相的分子聚集形状分类:GC、LC、SFC 等按固定相的分子聚集形状分类:GSC、GLC、LSC、LLC等按操作方式分类:柱色谱法、平面色谱法、毛细管电泳法等按色谱过程的分别机制分类:分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、 空间排阻色谱法、毛细管电泳法等毛细管电色谱法毛细管电色谱法CEC色谱法色谱法GSC液相色谱法液相色谱法 LC柱色谱法柱色谱法平面色谱法平面色谱法毛细管电泳法毛细管电泳法 CELLCLSCSECIECBPC纸色谱法纸色谱法薄层色谱法薄层色谱法TLCLLCLLCLSC气相色谱法气相

3、色谱法GCGC柱色谱法柱色谱法GLC超临界流体色谱法超临界流体色谱法 SFC二、色谱法的开展一色谱法的历史 二色谱法的现状和开展趋势1新型固定相和检测器的研制2色谱新方法的研讨 3色谱联用技术 4色谱专家系统 第二节 色谱过程和根本原理 一、色谱过程实现色谱操作的根本条件是必需具备相对运动的两相，固定相(stationary phase)和流动相(mobile phase)。色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配的过程。色谱过程组分的构造和性质微小差别 与固定相作用差别 随流动相挪动的速度不等 差速迁移 色谱分别。二、色谱流出曲线和有关概念色谱流出曲线是由检测器输出的电信号强度对时间

4、作图所绘制的曲线，又称为色谱图。 基线是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。基线反映仪器 (主要是检测器) 的噪音随时间的变化。色谱峰是流出曲线上的突起部分。正常色谱峰、拖尾峰和前延峰对称因子对称因子fs fs (symmetry factor) (symmetry factor) ：衡量色谱峰的对称性衡量色谱峰的对称性 ABAAWfhs2/)(2/05.0到20页到19页保管时间(retention time;tR)：从进样到某组分在柱后出现浓度极大时的时间间隔。死时间 (t0)：分配系数为零的组分，即不被固定相吸附或溶解的组分的保管时间。 调整保管时间 ( )：某组分由于溶解或被吸附于

5、固定相，比不溶解或不被吸附的组分在柱中多停留的时间。 0RRttt定性参数1Rt定性参数2 保管体积(VR)：从进样开场到某个组分在柱后出现浓度极大时，所需经过色谱柱的流动相体积。 cRRFtVc00FtV死体积(V0)：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间。固定相颗粒间间隙、导管的容积、检测器内腔容积的总和。定性参数3调整保管体积(adjusted retention volume; )：由保管体积扣除死体积后的体积 RVcR0RRFtVVVRRRR1 , 21212VVttr相对保管值(r) ：两组分的调整保管值之比留意：VR是定值，tR与FC成反比定量参数峰高(peak heig

6、ht；h)：组分在柱后出现浓度 极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的间隔。 峰面积(peak area；A)：色谱曲线与基线间包围的面积。 前往柱效参数规范差(standard deviation；)：正态色谱流出曲线上两拐点间间隔之半，即0.607倍峰高处的峰宽之半。 的大小表示组分被带出色谱柱的分散程度。越大，组分越分散；反之越集中。半峰宽 (W1/2)：峰高一半处的峰宽。 W1/2=2.355 峰宽 (peak width；W)：色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的间隔。 W=4 或W=1.699W1/2 前往总分别效能目的分别度(resolution；R)：又称分辨率。是相邻两色谱峰保

7、管时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。21RR21RR)(22/ )(1212WWttWWttR分别度分别度设正常峰，W1W2= 4 ，那么R=1.5时，99.7%面积(tR 3)被分开， tR =6 ，称 6 分别 。三、分配系数与色谱分别(一) 分配系数和容量因子 分配系数 (distribution coefficient；K)是在一定温度和压力下，到达分配平衡时，组分在固定相 (s) 与流动相 (m) 中的浓度 (C) 之比。ms=CCK分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度和压力有关。是组分的特征常数。容量因子(capacity factor；k)：在一定温度和压力下，到达分配平衡

8、时，组分在固定相和流动相中的质量(m)之比。摩尔数？ 又称为质量分配系数或分配比。分配系数与色谱分别msmmk 还与固定相和流动相的体积有关。mmssVCVCmsVVK容量因子与分配系数的关系tR=t0(1+ k) tR=t0(1+K ) 分配系数与色谱分别二分配系数和容量因子与保管时间的关系uvR v=L/tRu=L/t0RttR0ssmmmmSmmsmmVCVCVCNNNtttRkR11RttR0msVV0R00Rtttttk三色谱分别的前提KAKB 或kAkB 是色谱分别的前提。= t0(1+KA ) ARtmsVVBRt= t0(1+KB ) msVV tR= t0 (KAKB) ms

9、VVtR0 KAKBkAkB分配系数与色谱分别推导过程：第三节 根本类型色谱方法及其分别机制分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法空间排阻色谱法一、分配色谱法分配色谱法分别原理 利用被分别组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分别。mmssmsVXVXCCK溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，那么K越大。在LLC中K主要与流动相的性质 (种类与极性) 有关；在GLC中K与固定相极性和柱温有关。 分配色谱法固定相 又称固定液涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层 液体；化学键合相经过化学反响将各种有机 基团键合到载体上构成的固定相。流动相 气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。 液液分配色

10、谱法：与固定相不相溶的液体。正相液液分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性。 反相液液分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性。 分配色谱法洗脱顺序 由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决议。 正相液液分配色谱：极性强的组分后被洗脱。库仑力和氢键力反相液液分配色谱：极性强的组分先出柱。二、吸附色谱法分别原理 利用被分别组分对固定相外表吸附中心吸附才干的差别而实现分别。吸附过程是试样中组分的分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂外表活性中心的过程，即为竞争吸附过程 。XXYYamamnn+namnmaaYXYX=Kmmaamaa/XXVXSXK吸附系数与吸附剂的活性、组分的性质和流动相的性质

11、有关。吸附色谱法固定相 多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。硅胶外表硅醇基为吸附中心。经典液相柱色谱和薄层色谱：普通硅胶高效液相色谱：球型或无定型全多孔硅 胶和堆积硅珠。气相色谱：高分子多孔微球等吸附色谱法流动相 有机溶剂硅胶为吸附剂洗脱才干：主要由其极性决议。强极性流动相占据吸附中心的才干强，洗脱才干强，使k值小，保管时间短。Snyder溶剂强度o：吸附自在能，表示洗脱才干。o值越大，固定相对溶剂的吸附才干越强，即洗脱才干越强。表 17-1 一些溶剂在硅胶上的o值溶剂 溶剂强度o溶剂 溶剂强度o正戊烷0.00甲基特丁基醚0.48正己烷0.00醋酸乙酯0.48氯仿0.26乙腈0.52二氯甲烷0.40异

12、丙醇0.60乙醚0.43甲醇0.70吸附色谱法洗脱顺序 ka=KaSa/Vm在色谱柱Sa与Vm一定时，Ka大的组分保管强，后被洗脱，Ka小的组分在吸附剂上保管弱，先被洗脱。Ka与组分的性质极性、取代基的类型和数目、构型有关。 以硅胶为吸附剂：极性强的组分吸附力强。饱和碳氢化合物为非极性化合物，不被吸附。根本母核一样，引入的取代基极性越强，那么分子的极性越强，吸附才干越强；极性基团越多，分子极性越强 (但要思索其他要素的影响) 。不饱和化合物的吸附力强，双键数越多，吸附力越强。分子中取代基的空间陈列 三、离子交换色谱法分别原理 利用被分别组分别子交换才干的 差别而实现分别。分为阳离子交换色谱法和

13、阴离子交换色谱法。阳离子交换：阴离子交换：离子交换通式： 交换再生+3RNR+OH-ClRNR+3ClOH交换再生+RBARAB+RSO H+Na+Na+33HRSO四、空间排阻色谱法分别原理根据被分别组分分子的线团尺寸 进展分别。也称为分子排阻色谱法。空间排阻色谱法根据空间排阻steric exclusion实际，孔内外同等大小的溶质分子处于分散平衡形状：浸透系数： Kp =Xs/Xm 0Kp1 由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙的大小所决议。在一定分子线团尺寸范围内，Kp与分子量相关，即组分按分子量的大小分别。XmXs空间排阻色谱法固定相多孔凝胶：软质、半软质和硬质 主要性能参数平均孔径排斥极

14、限Kp=0：不能浸透进入凝胶的任何孔隙最低分子量 分子量范围：排斥极限Kp=0与全浸透点Kp=1之间的分子量范围围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。空间排阻色谱法流动相 要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低水溶性试样选择水溶液为流动相(称为凝胶过滤色谱gel filtration chromatography； GFC)；非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相 (凝胶浸透色谱gel permeation chromatography；GPC)。空间排阻色谱法保管体积与浸透系数的关系)1 (msPmRVVKVVsp0RVKVVVmV0分子线团尺寸分子量大的组分

15、，其浸透系数小，保管体积也小，因此先被洗脱出柱。小结色谱过程方程式：分配系数大的组分保管时间长保管体积大，晚流出色谱柱。K在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱中，分别为狭义分配系数K、吸附系数Ka、选择性系数KA/B和浸透系数Kp，Vs分别为色谱柱或薄层板内固定液体积、吸附剂外表积、离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。)1 (ms0RVVKtts0RKVVV第四节第四节 色谱法根本实际色谱法根本实际 21RR21RR)(22/ )(1212WWttWWttR要使要使R R大，必需：大，必需：1 1、tRtR大大- - k k大大-热力学热力学2 2、W W小小-峰展宽小峰展宽小-动力

16、学动力学 色谱实际包括两方面色谱实际包括两方面: 热力学实际：研讨分配热力学实际：研讨分配(分别分别)过程，过程，塔板实际塔板实际plate theory。 动力学实际：研讨各种动力学要素动力学实际：研讨各种动力学要素对峰展宽的影响，速率实际对峰展宽的影响，速率实际rate theory。一、塔板实际一、塔板实际 始于马丁始于马丁Martin和辛格和辛格Synge提提出的塔板模型。出的塔板模型。分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分别。点不同而分别。色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，按分配系数不同而分别。按分配系数不

17、同而分别。 塔板实际假定：塔板实际假定：在色谱柱内每一在色谱柱内每一“塔板塔板H内，组分内，组分在两相间瞬间到达分配平衡。在两相间瞬间到达分配平衡。流动相间歇式进入色谱柱，每次进流动相间歇式进入色谱柱，每次进入一个塔板体积。入一个塔板体积。分配系数在各塔板内是常数。分配系数在各塔板内是常数。纵向分散可以忽略。纵向分散可以忽略。一质量分配和转移一质量分配和转移 1、单一组分、单一组分BkB=0.5的分配和转移的分配和转移 设色谱柱的塔板数设色谱柱的塔板数n=5，即，即r=0、1、2、3、4或或n-1号。号。 将单位质量的将单位质量的B加到第加到第0号塔板上。号塔板上。 分配平衡后，分配平衡后，0

18、号塔板内号塔板内ms/mm 0.333/0.667。 进入一个塔板体积的流动相一次转进入一个塔板体积的流动相一次转移，移，经过经过N次转移后，质量分布符合二项式次转移后，质量分布符合二项式(ms+mm)N的展开式。的展开式。 如如N=3，展开式为：，展开式为：(0.333+0.667)3=0.037+0.222+0.444+0.296 0 1 2 3号号在固定相和流动相中的质量分布由在固定相和流动相中的质量分布由k(K)决议决议转移转移N次后，第次后，第r号塔板中的质量号塔板中的质量Nmr： rrNrNmmrNrNmms)!( !例：转移例：转移3次后，在第次后，在第2号塔板内的溶号塔板内的溶

19、 质分数质分数444066703330)23(232)23(23.!m 组分组分B(kB=0.5)在在n=5的色谱柱内及出口的分布的色谱柱内及出口的分布 N r 0 1 2 3 4 柱出口柱出口 0 1 0 0 0 0 0 1 0.333 0.667 0 0 0 0 2 0.111 0.444 0.445 0 0 0 3 0.037 0.222 0.444 0.296 0 0 4 0.012 0.099 0.269 0.395 0.198 0 5 0.004 0.041 0.164 0.329 0.329 0.132 6 0.001 0.016 0.082 0.219 0.329 0.219

20、7 0 0.006 0.038 0.128 0.256 0.219 8 0 0.002 0.017 0.068 0.170 0.170 9 0 0 0.007 0.033 0.102 0.114 10 0 0 0.002 0.016 0.056 0.068留意：留意：1、柱出口处的质量分数的计算。、柱出口处的质量分数的计算。2、质量浓度最大点的、质量浓度最大点的N，即保管体，即保管体积。积。2、两组分的分别、两组分的分别A(kA=1)和和B(kB=0.5)两组分两组分 组分组分A(kA=1)在在n=5的色谱柱内和出口的分布的色谱柱内和出口的分布 N r 0 1 2 3 4 柱出口柱出口 0 1

21、 0 0 0 0 0 1 0.5 0.5 0 0 0 0 2 0.25 0.5 0.25 0 0 0 3 0.125 0.375 0.375 0.125 0 0 4 0.063 0.250 0.375 0.250 0.063 0 5 0.032 0.157 0.313 0.313 0.157 0.032 6 0.016 0.095 0.235 0.313 0.235 0.079 7 0.008 0.056 0.165 0.274 0.274 0.118 8 0.004 0.032 0.111 0.220 0.274 0. 9 0.002 0.018 0.072 0.166 0.247 0. 1

22、0 0.001 0.010 0.045 0.094 0.207 0.124 结果：结果：组分组分B: k=0.5, 当当N=6和和7时，柱出口产生时，柱出口产生B的浓度最大点。的浓度最大点。 组分组分A：k=1，N=8和和9时，柱出口处到达时，柱出口处到达浓度最大点。浓度最大点。两组分开场分别，两组分开场分别，k小的组分小的组分B在柱后先出现浓度极大值在柱后先出现浓度极大值, 即先即先出柱。出柱。一根色谱柱一根色谱柱n=103以上，组分有微小的分以上，组分有微小的分配系数配系数(容量因子容量因子)差别即可实现完全分别。差别即可实现完全分别。分配系数分配系数(容量因子容量因子)不等是分别的前提。

23、不等是分别的前提。( (二二) ) 流出曲线方程流出曲线方程1 1、二项式分布曲线、二项式分布曲线以组分以组分A A在柱出口处的质量分数对在柱出口处的质量分数对N N作图。作图。N N 柱出口柱出口 0 0 0 0 1 0 1 0 2 0 2 0 3 0 3 0 4 0 4 0 5 0.032 5 0.032 6 0.079 6 0.079 7 0.118 7 0.118 8 0. 8 0. 9 0. 9 0. 10 0.124 10 0.124 k=1 k=1的组分从的组分从n=5n=5色谱柱中的流出曲线图色谱柱中的流出曲线图2、色谱流出曲线、色谱流出曲线当塔板数很大时，流出曲线趋于正态分布

24、当塔板数很大时，流出曲线趋于正态分布曲线。曲线。3、色谱流出曲线方程正态分布方程、色谱流出曲线方程正态分布方程描画组分流出色谱柱的浓度变化：描画组分流出色谱柱的浓度变化： 为规范差，为规范差，tR为保管时间，为保管时间，C为恣意时间为恣意时间t时的浓度，时的浓度，C0为峰面积为峰面积A，即相当于某组，即相当于某组分的总量。分的总量。22R2)-(0e2=ttCCt=tRt=tR时，时，C C有极大值：有极大值：CC20maxCmax即流出曲线的峰高即流出曲线的峰高h。一定时，一定时， 峰高峰高h取决于取决于C0。C0一定时，一定时， 峰高峰高h取决于取决于。 流出曲线方程的常用方式：流出曲线方

25、程的常用方式：22R2)-(maxe=ttCC不论不论ttR或或ttR时，浓度时，浓度C恒小于恒小于Cmax。C随时间随时间t向峰两侧对称下降。向峰两侧对称下降。越小，峰越锐。越小，峰越锐。 是柱效的标志。是柱效的标志。色谱峰面积色谱峰面积CC20max以以A替代替代C0，h替代替代Cmax，且，且W1/2=2.355 ，峰面积峰面积:A=h (2 )1/2A=1.065W1/2h 色谱定量的参数色谱定量的参数(三三) 实际塔板高度和实际塔板数实际塔板高度和实际塔板数 (height equivalent to a theoretical plate或或plate height, H) (pl

26、ate number, n) 是色谱柱效参数。是色谱柱效参数。实际塔板数与规范差峰宽或半峰宽和实际塔板数与规范差峰宽或半峰宽和保管时间的关系：保管时间的关系：2R)/(tn2R)16(Wtn221R)5.54(Wtn实际塔板高度实际塔板高度H =L/n 留意：留意：1、计算、计算n时使规范差峰宽或半峰宽时使规范差峰宽或半峰宽和保管时间单位一致和保管时间单位一致 2、n的单位的单位有效实际塔板数和有效实际塔板高度有效实际塔板数和有效实际塔板高度2ef)/(tnRHef =L/nef小结小结塔板实际解释了流出曲线的外形塔板实际解释了流出曲线的外形阐明了组分的分配和分别过程阐明了组分的分配和分别过程

27、提出了评价柱效的目的提出了评价柱效的目的但某些假设与实践色谱过程不符但某些假设与实践色谱过程不符 二、速率实际二、速率实际塔板实际的缺乏：塔板实际的缺乏： 组分在两相中不能够真正到达分配平组分在两相中不能够真正到达分配平衡；衡； 组分在色谱柱中的纵向分散不能忽略组分在色谱柱中的纵向分散不能忽略; ; 没有思索各种动力学要素对传质过程没有思索各种动力学要素对传质过程的的 影响；影响； 无法解释柱效与流动相流速的关无法解释柱效与流动相流速的关系；系； 不能阐明影响柱效有哪些主要要素。不能阐明影响柱效有哪些主要要素。 速率实际速率实际19561956年，荷兰学者范第姆特年，荷兰学者范第姆特(Van

28、Deemter)(Van Deemter)提提出了色谱过程动力学实际出了色谱过程动力学实际速率实际。速率实际。塔板高度涡流分散项纵向分散项传质阻抗项H = A + B/u + Cu涡流分散涡流分散(eddy diffusion)(eddy diffusion)也称为多径分散也称为多径分散速率实际速率实际( (一一) )影响影响H H的动力学因数的动力学因数涡流分散涡流分散 缘由：柱填充不均匀缘由：柱填充不均匀A=2A=2 dpdp速率实际速率实际( (一一) )影响影响H H 的动力学因数的动力学因数A A：涡流分散系数，其单位为：涡流分散系数，其单位为cmcm。 ：填充不规那么因子，填充技术和填料颗粒：填充不规那么因子，填充技术和填料颗粒形形状决议。状决议。dpdp：填料：填料 ( (固定相固定相) ) 颗粒的平均直径，颗粒的平均直径， dp dp小，小， A A小；但小；但dp dp 太小，太小， 和柱阻大。和柱阻大。纵向分散纵向分散(longitudin