免疫组化超详细步骤

1、免疫组化一实验目的：分别用KRASNRASHRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRASNRASHRAS蛋白的表达情况二实验原理：应用免疫学基本原理一一抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素酶金属离子同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术.实验试剂及耗材：经病理医生确认的肺癌组织切片、KRASNRASHRAS蛋白抗体、DAB4c冰箱、显微镜、烤片机四实验设备：切片机显色试剂盒抗原修复液PBS苏木素染料1%盐酸酒精溶液0.05%氨水二甲苯等五主要试剂配置配制1000毫升PBS需要1

2、42S2OZ用1A4®g应用液 A NaH2PO438.4g应用液B Na2HPO4缓冲液应用液A枸檬酸枸檬酸钠抗原修复液应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液配成1000毫升溶液36毫升应用B液，力口8.5gNaCI。配成1000毫升溶液10.55g29.01g配成1000毫升溶液配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝17.6g蒸储水750毫升，碘酸钠0.2g,冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸储水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。抗体说明书建议

3、的抗体稀释度N-Ras1:50-1:500H-Ras1:50-1:500K-Ras1:20-1:200六实验步骤：1组织常规石蜡切片厚度3-5um ,防脱片捞片后晾干，放入72C烤箱烤片2小时。2切片脱蜡水化程序二甲苯i、n脱蜡各12分钟;无水乙醇i、n各3分钟；（洗二甲苯）95%乙醇3分钟；85%乙醇3分钟；3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。4 组织修复采用高温高压法：压力锅中加入插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）pH6.0，0.01M抗原修复液约1000ml，切片1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。5停止加热并用流水冲

4、洗高压锅以降温，室温冷却。6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。7取出切片，擦干组织周围液体后滴加10%BSA寸闭液，37C孵育40分钟。滴加一抗（浓度配比,PBS稀释1:20、1:50、1:100、1:200）60ul,注意保持组织湿润状态但表面不能有液体，用试管使抗体全部覆盖组织面且不能有气泡，以使抗体能全部与组织接触。8 滴加一抗后放入专用孵育盒内，4C冰箱过夜。9 切片放入PBS缓冲液中清洗3分钟X3次，充分洗涤，防止因洗涤不净引起的非特异性染色。（前两次的PBS倒掉

5、）10 擦干组织周围液体后滴加70微升辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物（根据实际情况要求覆盖样本），37C温箱内孵育40分钟。PBS缓冲液洗涤3分钟X3次.11 显色，滴加现配适量DAB显色剂（在1ml试剂2（DAB底物液）中，加入1滴（约50ul）试剂1（DAB浓缩液），混合液，即配成DAB工作液），配置DAB显色剂的容器在冰冻切片机旁边的冰箱里，其它试剂在入门口冰箱。室温显色,5-20分钟。自来水终止显色。第一遍的自来水需集中处理，自来水洗涤3分钟。复染，苏木素染液中染色40秒，水洗1分钟。1%盐酸酒精溶液分化3秒，流水漂洗。蓝化10秒，流水漂洗。15脱水，切片依次置于85%乙醇，95%L醇各1分钟，无水乙醇I、n中各2分钟。16 透明，切片依次置