志贺菌_沙门菌和霍乱弧菌多重PCR快速检测体系的建立

1、志贺菌、 沙门菌和霍乱弧菌多重 PCR 快速检测体系的建立刘家云 龙铟 苏明权 樊新 张建芳 郝晓柯【 摘要】 目的 建立快速检测志贺菌、 沙门菌和霍乱弧菌的多重 PCR 方法。 方法 根据志贺菌 ipa H 基因、 沙门菌 ipaB 基因及 霍乱弧菌 EPSM 基因设计特异性 PCR 引物 , 加热煮沸法制备 DNA 模板 , 进行 PCR 扩增及琼脂糖电泳检测。 结果 应用所建立的多 重 PCR 方法能分别或同时快速、 特异地检测出志贺菌 606bp 、 沙门菌 314bp 和霍乱弧菌 482bp 的目的基因。 结论 初步建立了灵敏、 特异的一步法检测志贺菌、 沙门菌和霍乱弧菌的多重 PC

2、R 体系 , 可用于高危腹泻致病菌的早期快速诊断。 【 关键词】 志贺菌 , 福氏 ; 沙门菌 , 鼠伤寒 ; 弧菌 , 霍乱 ; 多重 PCR 【 中国图书资料分类号】 R37812E stab lishm ent of a system for simu ltaneous d etection of Shigella s pp. , Salmonella s pp. and Vibrio cholerae w ith mu lti 2 plex PCRLiu Jiayun , Long Y in , Su Mingquan , et al 1Department of Clinical ,

3、 X ijing , Fourth Military Medical University , X i an 710032, China【 Abstract 】 Objective T o establish a multiplex polymerase chain (for of S hi gella spp. , S almonella spp. and Vibrio cholerae . M ethods Based antigen H (ipa H in S hi gella spp. , invasion plasmid antigen B (ipaB S protein (EPSM

4、 in V. cholerae , three pairs of primer were the method and multiplex PCR was performed with premix Taq in an ABI 2720The were then analyzed by using agarose gel electrophoresis. R esu lts Under the opti 2 mized conditions , yielded 6062bp product from S hi gella spp. , a 3142bp product from Salmone

5、lla spp. , and a 4822bp product from V. cholerae , respectively. When the DNA extraction of multiple target organisms was included in the same reaction , two or three corresponding amplicons in different size were observed. C onclusions A rapid , specific and sensitive multiplex PCR system for simul

6、tane 2 ous detection of S hi gella spp. , S almonella spp. and V. cholerae has been established. The results suggest that the simultaneous amplifi 2 cation of several genes by multiplex PCR may provide an efficient and rapid diagnostic method for severe diarrhea. 【 K ey w ords 】 S hi gella f lexneri

7、 ; Salmonella ty phimurium ; Vibrio cholerae ; multiplex PCR 志贺菌、 沙门菌和霍乱弧菌是感染性腹泻常见的 致病菌 , 可导致细菌性痢疾、 食物中毒、 伤寒、 霍乱等肠 道传染病 1-2。 因此 , 快速检测样品中的致病菌对于这 些疾病的预防和治疗具有重大意义 , 但常规的微生物 检测方法需分离培养、 生化和血清学鉴定等多个步骤 , 操作复杂 , 周期长。 多重 PCR 技术能在同一 PCR 反应 体系内实现对多种病原体 DNA 的同步快速扩增 , 为病 原微生物的鉴定提供了快速、 灵敏、 特异的方法。 本研 究根据三种高危腹泻致病菌

8、的特异性基因序列设计引 物 , 建立了一步法检测三种病原体的多重 PCR 方法 , 可用于腹泻病原菌的快速诊断。1 材料与方法111 材料 痢疾志贺菌福氏 2a (S hi gella f lexneri 2a 、 沙门菌 (S almonella ty phimurium 及霍乱弧菌 (Vibrio cholerae 为本室保存菌株。 Taq DNA 聚合酶、 MgCl 2、 dNTP mixture 、 DNA marker 均为 T a K aRa 公司 产品。112 多重 PCR 特异性引物的设计 根据志贺菌的侵 袭质粒抗原 H (invasion plasmid antigen H

9、,ipa H 基因、 沙门菌的侵袭质粒抗原 B (invasion plasmid antigen B ,ipaB 基因及霍乱弧菌肠毒素细胞外分泌蛋白 (entero 2 toxin extracellular secretion protein ,EPSM 序列设计各 菌引物 3, 扩增片段长度分别为 606、 314、 482bp (表 1 。 引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。113 模板制备 取斜面菌落于盛有碱变性裂解液的 115ml 离心管中 , 充分悬浮菌体 , 置 100 水中煮沸表 1 用于检测志贺菌、 沙门菌及霍乱弧菌的多重 PCR 引物 T ab le 1 Multi

10、plex PCR primers used to detect S hi gella spp 1, Salmonella spp 1and V 1cholerae细菌名称目的基因引物序列产物大 小 (bp 志贺菌 ipaH F:5 2CCTTG ACCG CCTTTCCG AT A 23 606 R:5 2CAG CCACCCTCTG AGGT ACT 23沙门菌 ipaB F:5 2GG ACTTTTT AAAAG CGG CGG 23 314 R:5 2G CCTCTCCCAG AG CCGTCTGG 23霍乱弧菌 EPSM F:5 2G AATT ATTGG CTCCTGTG CAGG

11、CT 23 482【 作者简介】 刘家云 , 医学博士 , 主治医师。 主要从事临床感染性疾病 的实验室诊断及研究工作。 已发表论文 15篇 , 参编专著 2部。 E 2mail : jiayun fmmu 1edu 1cn【 作者单位】 710032 陕西 第四军医大学西京医院检验科 (刘家云、 苏明权、 樊新、 张建芳、 郝晓柯 , 中医科 (龙铟 【 通讯作者】 郝晓柯 ,E 2mail :haoxkgfmmu 1edu 1cn 0 9 1 1 10min ,10000r/min 离心 1min 后取上清液作为模板。按上述方法分别制备痢疾志贺菌、 沙门菌及霍乱弧菌 模板 DNA , 将

12、3种模板分别或混合进行 PCR 扩增。114 多重 PCR 体系 PCR 反应总体积为 25l , 其中10×Buffer 215l ,25mmol/L MgCl 2115l ,10mmol/L dN TP 015l , Taq 酶 3U/l , 模板 DNA 3l , 用于扩增目的基因的引物各 1l , 余下体积用无菌双蒸水补足。 在ABI 2720型 DNA 扩增仪上进行 PCR 反应 , 参数为 :94 预变性 5min ,94 40s ,62 50s ,72 1min , 共 35个循环 ;72 延伸 7min 。 扩增结束后取 PCR 产物 (5l 在 15g/L 琼脂糖凝

13、胶上电泳 , 观察并记录结果。 在上 述 PCR 反应体系中 , 同时加入 2对或 3对 (痢疾志贺 菌、 沙门菌及霍乱弧菌 PCR 引物及相应的模板 DNA , 用上述条件进行扩增及产物检测。 115 多重 PCR 体系的特异性试验 以痢疾志贺福氏 2a 菌、 沙门菌、 霍乱弧菌和非目的菌分别制备模板 , 的多重 PCR 体系条件下扩增 , 2 结 果211 PCR 3对特异性引物按所需扩增浓度混合后 , 加入上述 PCR 扩增体系中进行 PCR 扩 增 , 结果未出现任何扩增区带 , 而阳性对照出现 3条特 异性扩增区带 , 表明引物之间不会因相互干扰而出现 假阳性结果。 212 多重 P

14、CR 扩增结果 按照优化的参数进行多重 PCR , 扩增的结果为单一模板出现一条特异性扩增区 带 , 混合模板出现 2条或 3条特异性扩增区带 (图 1 , 与预期的扩增结果一致。图 1 目的菌株的多重 PCR 扩增结果M1. DL2000marker ; M2. 100bp marker ; 1. S hi gella f lexneri 2a ;2. Vibrio cholerae ; 3. S almonella ty phimurium ; 4. S hi gellaf lexneri 2a +Vibrio cholerae ; 5. S hi gella f lexneri 2a +

15、S almonella ty phimurium ; 6. Vibrio cholerae +S almonella ty phimurium ; 7. S hi gella f lexneri 2a +Vibrio cholerae +S almonella ty phimuriumFigu re 1 Multiplex PCR amplification of target bacteria3 讨 论多重 PCR 技术可在同一 PCR 反应体系内加入多对特异性引物一次扩增多个 DNA 片段 , 从而实现多种 病原体 DNA 的同步快速鉴定 4, 但它并非简单地将多 对特异性引物混合在同一

16、PCR 反应体系内就可进行 PCR 扩增 , 因反应体系中含有多对特异性寡聚核苷酸 引物 , 对引物的设计和选择比常规 PCR 反应更为严 格 , 必须充分考虑到各引物间的相关性和合理性。 ipa H 基因是志贺菌属的特异性毒力基因 , 是侵袭力的 特异性标志 , 沙门菌的 ipaB 基因编码吸附和侵袭上皮 细胞的表面抗原 , 霍乱弧菌 EPSM 编码肠毒素细胞外 分泌蛋白 , 均是保守的基因 5-7。 因此 , 本研究分别选 用志贺菌 ipa H 、 沙门菌 ipaB 、 霍乱弧菌 EPSM 为目的基 因以特异地检测目的致病菌。 引物设计时已排除 PCR 扩增产物间可能发生的错配 , , 比

17、 例、 , 引 在 PCR 模板制备 , 100 加热煮沸 30min 破细胞 , 离 心取上清为模板 , 较常规的细菌基因组 DNA 提取方法 简便、 快速。本研究初步建立了快速检测志贺菌、 沙门菌和霍 乱弧菌的多重 PCR 体系 , 实现了对多种病原体 DNA 的同步快速扩增 , 为病原微生物的鉴定提供了快速、 灵 敏、 特异的检测方法。【参考文献】1G ascon J 1E pidem iology , etiology and pathophysiology of traveler s diarrhea 1Digestion , 2006,73(Sup :1022G adewar S

18、, Fasano A 1Current concepts in the evaluation , diagnosis and management of acute infectious diarrhea 1Curr Opin Pharmacol , 2005,5(6 :5593K ong RY, Lee SK, Law TW , et al 1Rapid detection of six types of bacterial pathogens in marine waters by multiplex PCR 1Water Res , 2002, 36(11 :28024E lnifro EM , Ashshi AM , C ooper R J , et al 1Multiplex PCR :ptim i 2zation and application in diagnostic virology 1C lin Microbiol Rev , 2000,13(4 :5595Li Y, Mustapha A 1S i