利用可视化膜芯片检测9种转基因玉米

1、利用可视化膜芯片检测9种转基因玉米DOI：10.14088/jki.issn0439-8114.2016.11.055转基因作物进入食品领域后，有关转基因食品安全性的问题备受关注。为保护消费者的知情权，中国、日本、韩国及一些欧盟成员国均颁布了食品标签相关法律法规，要求对食品中成分进行明确标识（包括是否包含转基因成分），这就需要建立简便、快速、准确的方法来满足日常检测的需求。目前，现有技术主要是基于PCR1,2或多重PCR吉合电泳检测的方法3、实时荧光定量PCR4及基于免疫学的ELISA5。由于DNA§易在各种生物样本中获得高度的稳定性，基于PCR勺方法更有优势。然而，传统PCR方法只

2、能针对单一基因进行检测。多重PCR1可同时扩增多重靶标，但很难在后续电泳检测中区分大小相近的片段。同时，基于PCR勺方法还存在检测通量低的局限。基因芯片具有高通量、微型化、自动化的技术优势。近些年，有研究报道了应用基因芯片结合多重PC做术检测转基因事件6,7,但现有基因芯片技术主要以荧光为检测手段，分析仪器昂贵，并对操作人员具有较高的技术要求。本研究拟建立一种基于膜芯片的可视化基因芯片检测方法，该方法将碱性磷酸酶与底物之间的酶学显色反应引入检测体系，使阳性结果在芯片表面形成裸眼可见的点，检测结果可裸眼观察，同时也可配套灰度扫描仪进行定量分析。1材料与方法1.1 试验材料转基因材料主要为种子和玉

3、米粉，包括转基因玉米(Bt176、Bt11、MON81、0GA21、T25、TC1507、DAS-59122、NK603、MIR604)、转基因棉花(MON1445MON15985、转基因大豆(GTS40-3-2)及非转基因材料。1.2 试剂及仪器植物基因组DN屣取试齐ij盒(DNeasyPlantMiniKit)、多重PCR式剂J盒(MultiplexPCRkit)均为Qiagen公司产品；核酸杂交试剂(DR.ChipDIYKitTM)为台湾晶宇生物科技公司产品；点样仪(晶芯SmartArrayerTM-16型)为北京博奥生物芯片XX公司产品；杂交尼龙膜为美国Pall公司产品；PCRa(Bi

4、o-rad)、紫外交联仪(Scientz03-n型)为宁波新芝科技XX公司产品。1.3 引物及探针设计采用软件Primepremier5.0设计引物，共10对。为使PCR适用于加工过的材料，引物按以下原则选取：扩增产物长度在100300bp；解链温度在5560C；适合多重PCR引物5'端以生物素修饰。探针共12组(包含杂交阳性及阴性质控探针)，探针设计应用网络在线设计工具(http：.tw/ups/)获得，同时，以玉米醇溶蛋白基因(Zein)作为内源参照基因设计探针，以EV71病毒基因特异性探针作为杂交阳性质控(生物素化EV71病毒基因PCRT物

5、由DR.ChipDIYKitTM试剂盒提供），poly（T）30作为杂交阴性质控，所有探针5'端以poly（T）15修饰。引物及探针序列由生工生物工程（上海）XX公司合成。引物及探针序列见表1。1.4 膜芯片制备应用芯片点样仪将合成探针按预设模式点样于尼龙膜上（图1）,阴性、阳性杂交质控探针浓度为10以mol/L,其他探针浓度为20以mol/L。探针点好后自然风干，于紫外交联仪中交联，波长254nm，3min。紫外交联后用0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）-0.05%Tween20漂洗3次，再用去离子水漂洗3次，风干密封，4保存备用。1.5 基因组DNAS取所有测试样本基因组DN

6、陶植物基因组DNAg取试剂盒（DNeasyPlantMiniKit）提取，操作步骤参见试剂盒说明。应用紫外分光光度计测定DNM纯度和浓度。1.6 多重PCRF增将样本DN续度稀释至50100ng/以L,于0.2mLPCR反应管中依次加入PC戏冲液、dNTPDN限板、引物、HotstarTaq酶，补充去离子水至30以L,各组分浓度参照试剂盒说明书。多重PC膝件如下：94C变性5min；94C30s,55C30s,7230s，35个循环；7210min。1.7 芯片杂交及结果判定PC寸物于PC做中95c变性5min后立即置于冰上，3min后取5以L与100以L杂交缓冲液（杂交缓冲液含有杂交阳性质控

7、探针互补片段）混匀，加样于芯片点样区，用盖玻片封闭，于45c杂交40min。杂交完成后，用清洗液（DR.ChipDIYKitTM试剂盒提供）清洗2次，再滴加100以L1：1000稀释的Streptavidin-AP孵育15min，用清洗液清洗2次，加入50倍稀释的底物NBT/BCIP,避光室温反应5min后弃掉显色液，用去离子水洗2次，吹干，裸眼观察杂交结果。2结果及分析2.1 芯片检测的特异性芯片检测特异性与探针特异性密切相关，本研究应用在线探针设计程序UPS设计了相关转基因玉米的探针8-10。为了验证芯片检测的特异性，应用制备的膜芯片检测商业化的转基因材料（玉米、棉花、大豆）及非转基因材料

8、。为提高检测效率，首先对作物种类进行初筛。选择玉米醇溶蛋白基因作为玉米的内源参照基因，同时为验证杂交过程的正常进行，以EV71相关序列设计了杂交阳性质控（其互补序列整合在试剂盒提供的杂交缓冲液中）。图2为芯片检测的鉴定结果，对应探针位点、内源参照基因位点和阳性质控位点均有明显的信号响应。转基因大豆、棉花及非转基因材料除杂交阳性对照点外，无任何信号反应。同时，对芯片鉴定的样本也进行了PCRT物测序比对分析，与芯片鉴定结果一致。结果表明，芯片具有良好的检测特异性。为了进一步检验芯片多重靶标分析的能力，将不同转基因株系基因组DNA昆合进行多重PCR然后进行芯片检测，结果如图3所示。由图3可见，制备的

9、检测芯片可以进行多靶标的同时检测。芯片上不同点之间信号强度存在一定差异，这是由于在多重PCR过程中不同引物对之间相互影响，导致不同的扩增效率，但并不影响对多重靶标的同时鉴定。2.2 芯片检测的灵敏度为了确定芯片检测的灵敏度，以Bt176为材料，将转基因玉米Bt176与非转基因玉米按不同比例混合（转基因玉米占总混合材料0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%），以此混合样品提取DNAt进行PCRT增，应用检测芯片进行检测。结果表明（图4），随着转基因成分含量逐渐减少，杂交信号逐渐减弱，0.5%的转基因Bt176就可以被检测出来。2.3 芯片检测的重复性为了测试芯片检测的重复性，利用同批次及不同批次制备的芯片对同一