培养基制备的基本方法和注意事项

1、培养基制备的基本方法和注意事项1.培养基配方的选定同一种培养基的配方在不同着作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外一般均应尽量收集有关资料加以比较核对再依据自己的使用目的加以选用，记录其来源。2. 培养基的制备记录每次制备培养基均应有记录，包括培养推各称，配方及其来源和各种成份的牌号。最终pH值、消毒的温度和时间制各的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。3. 培养基成分的称取培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上做出记号，并将所需称取

2、的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后还应进行一次检查。4. 培养基各成份的混合和溶化培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢锅加热溶化也可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动，以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化迄至煮沸。如为琼脂培养基，应先用一部分水将琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而

3、丢失的水分，最后必须加以补足。5. 培养塞pH的初步调整培养基各成分完全溶解后，应进行pH的初步调正，因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，例如，牛肉浸液约可降低.而肠浸液pH却会有显着的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终pH，保证培养基的质量。pH调正后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。6. 培养基的过滤澄清液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显着沉淀，因此，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应拆叠成折扇成漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤

4、。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。即将冷却至55-60的培养基放入大的三角烧瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的1/2，每1000ml培养基加入1-2个鸡蛋的蛋白强力振摇3-5分钟，置高压蒸汽灭菌器中、121加热20分钟、取出趁热以绒布过滤即可。若能自行沉淀者，亦可静置冰箱中1-2日、吸取其上清液即可。7. 培养基的分装培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，其外还双用防水纸包扎（现试管

5、一般多有用螺旋盖者）。分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂抖面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为恰当。分装容器应予先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻瓶中，随该批培养基同时灭菌，以为测定该批培养基最终pH之用。8. 培养基的灭菌一般培养基可采用121高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%如或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应从无菌操作

6、技术抽取和加入于经冷却约50左右的培养基中。琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出、待冷至55-60时，摆置成适当斜面、待其自然凝固。9. 培养基的质量测试每批培养基制备好以后应仔细检查一遍：如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。将全部培养基放入36±1恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。用有关的标准菌株接种1-2管或瓶培养基，培养24-48小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。10. 培养基的保存培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基

7、不宜超过3天。每批培养基均必须附有该批培养基制各记录副页或明显标签。培养基的常规配制程序一、目的要求了解培养基的配制原理。了解培养基常规配制程序。了解培养基配制过程各环节的要求和注意事项。二、基本原理正确掌握培养基基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础，由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相向。三、实验材科（1） 药品待配各种培养的组成成分，琼脂，1mol/LNaOH溶液，1m

8、ol/l（升，统一用大写）HCl溶液。（二）仪器天平或台秤，高压蒸汽灭菌锅。（3） 玻璃器皿移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等。（4） 其他物品药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸等。四、实验内容（一）玻璃器皿的洗涤和包装1 玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将锥形瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡。再用自来水及蒸馏水冲洗，洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。2 灭菌前玻璃器皿的包装(1) 培养皿的包装培养皿由一盖底组成一套。可用报纸将几套培养皿包

9、成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。(2) 移液管的包装在移液管的上端塞入小段棉花(勿用脱脂棉)。它的作用是避免外界及口中杂菌吹入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左有。棉花自身长度约1-1.5cmt塞棉花时，可用一外圈拉直的曲别针，将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45度角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条

10、，折叠打结，准备灭菌(见图511)。(二)液体及固体培养基的配制过程1 液体培养基配制(1) 称量一般可用1/100粗天平称量配制培养基所需的各种药品。先按培养基配方计算各成分的用量，然后进行准确称量。(2) 溶化将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水)，用玻棒搅动，加热溶解。(3) 定容待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如某种药品用量太少时，可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中。(4) 调pH一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪出一小段pH试纸，然后用镊子夹取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如培养基偏

11、酸或偏碱时，可用1mol/lNaO城1mol/lHCl溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOHHCl溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至达到所需pH为止。(5) 过滤用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。2固体培养基的配制配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂（15-2）加入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去水分。（三）培养基的分装根据不同需要，可将己配好培养基分装入试管或锥形瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管

12、口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。1 试管的分装取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹住玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内（图512）。装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15X150mm时，液体培养基可分装至试管高度14左右为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1/5（约34m1）;半固体培养基分

13、装量为管高的13为宜。2 锥形瓶的分装用于振荡培养微生物用时，可在250m1锥形瓶中加入50ml的液体培养基，若用于制作平板培养基用时，可在250ml锥形瓶中加入150ml培养基，然后再加入3g琼脂粉（按2%计算），灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。（四）棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或锥形瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及锥形瓶口加上棉花塞等。1 试管棉塞的制作制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也

14、可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞(图513)。制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入。棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的23在试管内，13在试管外(图514)。目前也有采用金属或塑料试管帽代替棉塞。直接盖在试管口上。灭菌待用。将装好培养基并塞好棉塞或盖好管帽的试管拥成一捆，外面包上一层牛皮纸。用铅笔注明培养基名称及配制日期，灭菌待用。2 锥形瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上。目前也有采用无菌培养容器封口膜直接盖在瓶口，既保证良好通气，过滤除菌又操作简便，故

15、极受欢迎。在装好培养基并塞好棉塞或包上八层纱布或盖好培养容器封口膜的锥形瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线绳捆好，灭菌待用。(五)培养基的灭菌培养基经分装包扎之后，应立即进行高压蒸汽灭菌，100Pa灭菌20min(灭菌条件根据培养基不同有所差异，含糖培养基105，30min)。如因特殊情况不能及时灭菌，则应暂存于冰箱中。（六）斜面和平板的制作1 斜面的制作将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面（图515）。斜面长度不超过试管长度12为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。2平板的制作将装在锥形瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50

16、左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多，温度低于50，培养基易于凝固而无法制作平板。平板的制作应采用无菌操作，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部或试管，左于同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，月左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入10-12m1的培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿、使培养基均匀分布于整个平皿中、冷凝后即成平板（图516）。（七）培养基的无菌检查灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好从中取出1-2管（瓶），置于37恒温箱中培养12天，确定无菌后方可使用。（八）无菌水的制备在每个250mL的锥形瓶内装99mL的蒸储水并塞上棉塞。在每支试管内装

17、4.5m1蒸储水。塞上棉塞或盖上塑料试管盖。再在棉塞上包上一张牛皮纸。高压蒸汽灭菌，100Pa灭菌20分钟。一、MS培养基母液的配制母液成分规定量浓缩倍数称取量nig)母液体积(ml)配制1升培养a吸取册定容瑜号种类大KNO319001019000¥,NH4NO31650101650010001兀MgSO4-7H2O370103700100素KH2PO41701017002CaC：l;-2H2O4401044001000100VnSO44H2O22.31002230ZnSO4-7H2O8.61008603微H3BO36.2100620量KI0.8310083100010兀Na2Mo(

18、J47H2O0.2510025素CuSO4.5H2O40.0251002.5Co：L2.6H2O0.0251002.54铁Na2-EDTA37.31003730100010款FeSO4.4H2O27.81002780甘氨酸2.01001005斤盐酸此哆酚0.510025机盐酸硫筱索0.1100550010物烟酸0.5100256肌酸100100500050010注造：1.大量元索按照北用时离io倍的数值称取,分别将各种化合物称量后.除A-A*Z*4/Ji<-tA»4-、十-4C1I.Wflb->arriIr-irvI|II»Ivv#IIi注意：I.大量元素按照使

19、用时岛10倍的数值称取.分别将冬种化令物称量后.除CuCLrZILO单独配制外,具余化公仞混公在500ml烧杯卜加适量熬镐水溶解，用坡瑞棒摸界促溶.倒入1000ml容盘瓶中用蒸偏水定容至划定,置小口瓶中保存,贴上标签注明化作物名称（或编号）.浓缩片数,配制日期和配制省姓名.CaCIHQ配制同上司J另小口艇中.2 .微量元素骨液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除诙盐（FcSO4Hq和Na,EDTA.2H式T作为州单独忧的卜.其余化合物可混合酉烧杯内加少量蒸馈水溶解后.定容在1000ml客:量瓶中,置小口瓶中保存.贴上标签.3 .铁盘的U将FcSOZ/HQ和NaEDTA.2

20、Hq分别溶于450ml熨瑞水中.加热.（限更要）不断搅拌.海解后.两液混合.调PH至55加水定容至1000mL置于小口瓶中.贴上标签。4 .仃机物司液归制.披母液娈求浓缩50倍.除前毡按3%单独I临时称0外.其余分别称量后.溶解，定容在5（X）ml容量瓶中,置于小口瓶中保存贴上标签.5 .母液最好在2Tle的冰箱中心存.特别是有机类物项,贮存时间不仃过长，无机盐母液最好在一个月内用完.如发现方霉两和沉淀产生,就不能再使用。1 .制备时液和营养培养基时.所用蒸端水或无离子水必须符合标准要求.化学豹晶必须是高纯度的分析纯）。2 .称依约物采用岛灵敬度的天半.每种狗地专用一约地.生长调节剂母液配制;

21、为了掾作方使.节约时间,生长调节剂也可如同尼制母液一样.先配成晾液.这样比制44UmI9r*I，</V*LI一f=0&c=newS.&cf=1&ch=0&di=8&fv=0&is_app=0&jk=ad58efeed63b8a3b&k/Inaijiiai«iiat*«in）iat1，<jik.iqjlet>iituiti»t>in，/AAi./JVRW/JI'i：e'J.Tl兀F1U以为“区2f|HLg培养基时只要梢加计算,按需要量:取即可。不同药品在足制时若不

22、溶于水,可用少量不同的洛剂先潘解.一乙酸naa）.明晚乙酸（IAA）,赤霉索（GA3）.2.4.D等生长卷和玉米索（ZT）可先用少量95%酒精溶解.然后加水,如溶解不完全再加热、激动水（KT）和&水基曝吟BA）可滔丁少量hnoL'L的盐酸中,叶酸需川少最稀风水溶解.称取50mg生K调节物质，溶解后在100ml的容量瓶中汽容配制的出淞句毫升则含有生长调节物质0.5mg.配制后一般要求在低温（0-4D保存.配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调巾剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即4»二.培养基配制和灭菌养培养基配制程序（一）.母液吸取量的计粗配制培养基的升数

23、公式I：母液吸取量二与液体枳（CC）X母液浓缩倍数培养基要求的占量公式2：母液吸取量=（芥种生长调节剂）厚液怔CC的含星（二）各种母液按物世星号排列A.大量元素：B.QiCL.2IW：C.微量元素：.钛盐：E.有机愉F.生长素泰乙酸CXAA：配制0.5mg/ml的NAA称取50ng.NAA用少量99%酒帖溶解后加燕馈水定容至1000ml；G.细胞分裂聿、激动茶KT）配制0.5mg/ml的KT称50mgKT用少量INHCL溶孵后.加蒸埼水定容至100mL（三）配制培养基COOOml）L琼脂：称取57g琼脂.加入300ml黄储水加热溶解直至完全溶解为止.2 .糖3%用质量较好的白糖代皆称取30g白

24、糖.溶丁溶仃琼脂的300.nl-值水中.3 .各种母液的吸取（培养基IL）（I）用50ml量筒量取大量元素母液（A和CaCl22H,O母液（R）各l0ml（2） 分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C）,铁-CD）付液各10ml（3） 用10ml移液管或吸管吸取有机物<H）10ml（4） 移取激素将上述溶液全部混合于麻脂与此枯沼淞中.混合均匀后加热至80C左右.用敏度计或布定PH试纸泅定培养笔的PH一般要求5.8-6.0-过M过破则用INNaoH和INH（L凋整a二.分装：用一个按有股管的分装粽趁热装培养基l<X）0ml培养基分装到25-30个：三角躯也用个三角肮约30mi左仃

25、（一般占试管、三角肮容量1/47/3左右）注：培齐基勿研版里.三.包装：分装好的三角瓶;用甘H膜包扎好，标明用齐葩代号即切进行灭曲。用具清理和洗涤:各种母液按原位摆整齐,用过的下筒,移淞管、烧坏,铝锅等用水洗涤干净.然后按次方放回原处.三、施压蒸汽灭菌徜的使用方法具体操作步骤.1 .高乐福放水至平把架二：2 .把包扎好的培养基装入冷压纲；3 .盖上热压粥需，上紧螺制（注意对角拧紧螺帽）关上气阀和安全阀.4 .然后接通电源.5 .压力计升至O.OSMPa时.打开放气何,冲除冷空气（此步很重要）.6 .排除冷空气后，关闭放气阀.气压力升到O.IIMPa位置时.开始计算灭曲时间.具体方法：当压力谒指

26、针升至0,l2MPa时,关电源.待指针下降至O.IIMPa时接通电源,不断瓶更此操作过程.维符2U分钥L7 .火苗时间达到20分钟后.除去电源.打开放气阀（注点要逐渐放气）待向压港内的空气完令排除后.打开热东灭阑钢熊（注意对角打松螺帕）稍待冷后再把培养基取出.8 .经过灭菌的营养培养基不H放置太长，应尽早使用.田为在使泮前能检度培养基有无微生物污染.可将培养基置于25t下保存4天.如果培养基满要JT存较长时间.可在4.。低温下保存。灭的高压祸力.大型腕式、中型立式、小型手提式等名冲型号和规格.无论哪种型号.操作的步骤都很相近.进水一放进培养某一能象锅盖f关上放汽阀一检杳安仝一接上加热滤一特压力

27、升至0O5MPa时持佃内冷空气.关上放气阀O.1IMPMI21'C）下火的2a25分钟.保外稔定压力f除热源一逐渐打开放气阀一弼内空气排除完后一开放他盖一梢冷后取出培养基0Ph无菌操作技术<-）柏物材料表面一消赤剂灭调刈外荆1皿*”|器的的M姗及以XIMUuilPJ出的，瞽在以触冷4饱；大11匕处，达*一口给入怯表川收）、ttvIr，n1"八九ni/je-产i±'j人作的步骤都很相近.进水一放进培养基一族联儡流f关上放汽陀一检告安全阀一接上加热源一待压力升至0.05MPa时拌恻内冷空气.-.（工鸿f<MlMPa（l21P）卜火苗2525分钟.保拉

28、稳定压力一除热源一逐渐打开放气阀一辆内空气抻除完后一开放祸盖一稍冷后取出培养珏。四、无菌操作技术一植物材料表面一消毒剂灭菌从外界或室内选址的植物材料都不同科股地带有各种微生物。这些污染源一H带入培养基.便公迅成J防基污染.因此,：植物材料必须歼严格的在向灭菌处理.再经无菌投人".培养基上，这一过程叫做接种L接种步理:第一注：洁理材料流水冲洗加入吐温（或洗衣粉）清洗一一自来水冲洗第一步：对材料的表面浸制灭例i：70%酒精浸1630秒-无菌水第三步：灭菌剂处理ff0.11%升乘5,8|11（或其他灭前剂）第四步：无菌水进行冲洗注意事项:】.灭侑剂一股要喻时配制.现配现用.升汞可以用期诚存

29、.2冈去除牧容易的火的剂火前后无的水冲洗34次升水-般5-8次,毋次不少于3mm3.火谴时要轻后的携抖，消除气泡,使消而史彻底.1.灭的时间是从倒入消揖液开始至值入无由水时为止°r-3eEf"八1"1*、l3 .火闲时受柱柱的猊拜，冷除，泡忸冷曲更却履.4 .灭菌时间是从例入济市液开始.至例入无茵水时为止.5 .灭菌液要充分没没材料6 .无声操作可按以下步票进行,（1）在接种3天前用甲解朦港接种室,并于投种前3小时打开其内紫外线灯进行条前；（2）在接种前20分钟,打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯;（3）接种员先洗净双手,在缓冲间换好专用实验服并换穿施鞋等；（4）上工作台后,用酒精棉球搽拭双手,特别是指甲处,然后操找工作台阳；（5）先用酒精桃球掾拭接触工具,再将搬了和的刀从头至尾过火遍.然后反发过火尖蜡处.时培荆m要过火烤干；（6）接种时