经济高效的禾谷镰孢菌原生质体遗传转化系统的建立

1、经济高效的禾谷镰孢菌原生质体遗传转化系统的建立侯毅平,周明国基金项目:高校博士点基金(20120097120009作者简介:侯毅平,(1984-,男,讲师,主要研究方向:杀菌剂毒理与抗药性。通信联系人:周明国,(1958-,男,教授,主要研究方向:植物病害化学防治。E-mail: mgzhou(南京农业大学植物保护学院,南京 2100955 摘要:禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum 原生质体遗传转化技术是建立禾谷镰孢菌突变体文库及研究其功能基因组的一种重要方法,本文以抗氰烯菌酯的禾谷镰孢菌Y2021A 为供试菌株,研究酶解材料、酶组合、酶浓度、酶解时间、酶解温度和最佳酶解材料

2、的量对禾谷镰孢菌原生质体制备的影响,优化胞壁降解酶系统,并将1.7kb 的潮霉素磷酸转移酶基因片段(hph 转化到供试菌株中,计算转化效率,PCR 验证转化子。结果表明,制备禾谷镰孢10 菌原生质体最适宜的条件为每毫升2%崩溃酶(Drislase 和2%蜗牛酶(Snailase 混合酶液中加入0.12 g 幼殖体,30 酶解1.5 h 。hph 片段的转化效率可达 40-50个转化子/g DNA 片段, PCR 检测表明,hph 已插入转化子的基因组中。该文成功的建立了经济高效的禾谷镰孢菌原生质体遗传转化技术平台,为建立禾谷镰孢菌突变体文库及研究其功能基因组提供了的必要的技术支持。15关键词:

3、遗传学;禾谷镰孢菌;原生质体制备;遗传转化中图分类号:Q341Establishing of an economic and efficient genetic transformation system of protoplast for Fusarium20 graminearumHOU Yiping, ZHOU Mingguo(College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, NanJing 210095Abstract: The genetic transformation of protoplast for F

4、usarium graminearum is a important technique of establishing mutation library and studying functional genome. In this research, 25 JS399-19HR strain Y2021A of Fusarium graminearum was used for studying the effect of the different digesting materials, enzyme combination, enzyme concentration, digesti

5、ng time, digesting temperature and weight of the best digesting material on protoplast preparation. Then the DNA segment (1.7kb of hygromycin resistant gene B (hph was transformed into the protoplasts of JS399-19HR strain Y2021A. The efficiency of transformation was calculated and the 30 tranformant

6、s were detected by PCR. The optimum condition for preparing protoplasts was: one milliliter enzyme mixture of 2% Driselase and 2% Snailase digested the 0.12 g germLings at 30 for 1.5 hours. The efficiency of transformation was up to 40-50 transformants per microgram of DNA and the fragment hph had i

7、nserted into the genome of transformants by the identification of PCR. An economic and efficient genetic transformation system of protoplast for Fusarium 35graminearum was successfully established, which was an essential technology for establishing mutation library and studying functional genome Fus

8、arium graminearum.Keywords: Genetics; Fusarium graminearum; Protoplast preparation; Genetic transformation 0 引言40 禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum 是小麦赤霉病(Fusaruim head blight of wheat 的病原菌, 小麦赤霉病是一种世界各地均有发生的流行性病害,是我国小麦生产中最重要的病害之一1-5。多发生在穗期多雨、气候潮湿地区6-10。在我国,长江中下游冬麦区和东北春麦区发生最严重,长江上游冬麦区和华南冬麦区也经常发生11。45原生质体技术

9、是研究丝状真菌生理、生化、遗传学及改良菌种的一种重要方法,为开展丝状真菌的基因工程研究提供了一条行之有效的途径12。自1973年Mishra 和Tatum13首次报道粗糙链孢霉(Neurospora crassa的DNA转化以来,利用原生质体作为分析遗传基因的实验材料以及进行性状转化已备受关注。近年来,有关植物病原真菌原生质体的制备研究国内外已有较多报道14-19,在原生质体遗传转化中,大量原生质体的获得是前提和关键20。50目前禾谷镰孢菌原生质体制备的方法已有报道21-25,但是直接引用他们的方法并不能得到理想的原生质体进行转化或者受到酶价格的限制。本文研究目的是建立经济高效的禾谷镰孢菌原生

10、质体遗传转化技术平台,为建立禾谷镰孢菌突变体文库及研究其功能基因组提供必要的技术支持。1材料与方法1.1供试菌株55禾谷镰孢菌(Fusarium graminearumY2021A是野生型菌株2021经药剂驯化获得的对氰烯菌酯表现高抗的菌株。1.2转化片段含有潮霉素磷酸转移酶基因(hph的质粒pKHt(图1-1由浙江大学马忠华教授惠赠, 60扩增潮霉素基因片段的引物为hygbF: GGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGG,hygbR: GGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTG,由上海生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应所用的LA Taq DNA聚合酶购自宝生物工程(大连有限公司

11、(TaKaRa Biotechnology(Dalian Co. Ltd.,TaKaRa LA Taq 25µL PCR反应体系:TaKaRa LA Taq(5 U/µL,0. 25 µL;10×LA PCR Buffer II(Mg2+ Free,2.5 µL;MgCl2(25 mmol/L,2.5 µL;dNTP Mixture(各 2.5 65mmol/L,4.0 µL;模板 DNA,约1.0 ng;引物1(20 µmol/L;0.5 µL;引物2(20 µmol/L,0.5 µ

12、L;蒸馏水定容至25µL。反应条件为94 10 min; 94 1 min, 65 1min, 72 2min, 34 cycles; 72 10 min; 12 for ever. PCR扩增的hph片段经Axygen胶回收试剂盒纯化。 70图1质粒pKHt图谱Fig.1 Plasmid pKHt1.3培养基马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA或马铃薯蔗糖培养基(PS用于菌株的分离、纯化、一般培养与保存。3%绿豆汤培养液26用于禾谷镰孢菌产生分生孢子。YEPD-2G27: 酵母粉3 g,蛋白胨10 g,葡萄糖20 g,蒸馏水1 L;75再生培养基: 酵母粉1 g,酶水解干酪素1 g,琼脂1

13、6 g,蔗糖274 g,加蒸馏水定容至1 L;覆层培养基: 同再生培养基,用10 g琼脂糖取代琼脂并加入终浓度为100 g/mL的潮霉素B便于对转化子的筛选。1.4试剂80酶制剂:崩溃酶(Driselase, D(Sigma公司,裂解酶(Lysing Enzyme, L(Sigma 公司,几丁质酶(Chitinase, C(Sigma公司,蜗牛酶(Smailase, S(北京百泰生化技术公司。所有酶液用0.7 mol/L NaCl溶液配制,经700 g离心2 min后取上清,于-20 保存备用。85其他试剂:STC(0.8 mol/L 山梨糖醇, 50 mmol/L CaCl2, 50 mmo

14、l/L Tris-HCl, pH 8.0;SPTC,含40% PEG6000的STC;潮霉素B(hygromycin B,Calbiochem分装;二硫苏糖醇(DTT;肝素钠(5 mg/mL等。1.5原生质体制备方法参考Robert H. Proctor et al25和Salch et al28,并做适当的修改。取适量的酶解材料, 90加入10 mL混合酶液(2.5% D,0.5% L,0.005 % C ,0.7 mol/L NaCl 溶液配制,700 r/min 离心2 min,取上清,30 振荡(85 r/min酶解1-1.5 h,显微镜下用血球计数板对原生质体进行计数,计算原生质体数

15、量,每个试验设三个重复。1.5.1酶解材料的选择分别用分生孢子、菌丝体和幼殖体(萌发的分生孢子进行酶解,其它操作步骤同上。95菌丝体、分生孢子和幼殖体的制备如下:分生孢子制备:接种禾谷镰孢菌菌株Y2021A于PSA培养基,25 培养3 d,取直径 5 mm菌落边缘菌丝块若干块接种100 mL 3 %绿豆汤培养液中,25 下振荡(175 r/min培养7 d。2层擦镜纸过滤,离心,用灭菌水洗涤2次,离心收集。菌丝体制备:挑取培养皿中的菌丝接入PS中, 25 下振荡(175 r/min培养24 h, 加100入DTT使其浓度为0.0025 mol/L,保持60 min,取出培养物,在匀浆器中研磨,

16、使菌丝断裂分散,然后离心收集,用0.7 mol/L NaCl洗两次,即得供试的菌丝体。幼殖体制备:将收集的分生孢子悬浮液接种于100 mL YEPD-2G培养基中,25 下振荡(175 r/min培养12-14 h,当芽管长度达到孢子直径的3-10倍时,2层擦镜纸过滤,0.7 mol/L NaCl 溶液洗涤两次,离心收集幼殖体。1.5.2酶组合对原生质体制备的影响105用以上最佳条件,采用2% D、2% L、2% S、2% D + 2% L、2% D + 2% S和2% L + 2% S等6种酶组合制备原生质体,其它操作步骤同上。1.5.3酶浓度对原生质体制备的影响用以上最佳条件,将最佳酶组合

17、设置1%、1.5%、2%、2.5%、3%五个浓度制备原生质体,其它操作步骤同上。1101.5.4酶解时间对原生质体制备的影响用以上最佳条件,分别酶解 0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h, 其它操作同上。1.5.5酶解温度对原生质体制备的影响用以上最佳条件,分别在26 、28 、30 和32 条件下进行酶解,其他操作步115骤同上。1.5.6最佳酶解材料的量对原生质体制备的影响用以上最佳条件,分别取0.5、0.8、1、1.2、1.5、2 g最佳酶解材料进行酶解,其他操作步骤同上。1.6原生质体遗传转化120方法参考Andrew G.Tag et al23和Frank J

18、. Maier et al24,并做适当的修改。用最佳条件制备禾谷镰孢菌原生质体,将原生质体用3层擦镜纸过滤,0.7 mol/L NaCl 溶液冲洗,1000 g离心5 min,STC洗三次,离心收集,冰上放置备用。取80 L原生质体液悬浮液加入转化管中,然后加入20 l SPTC,轻轻混匀,依次加入110 g DNA和5 l肝素钠溶液,轻轻混匀后冰上放置30 min,加入1mL SPTC溶液轻轻混匀,室温放置20 min,加入到不高125于43 的100 mL再生培养基中,摇匀,倒平板,25 培养12 h,覆以含100 mg/mL 潮霉素B 的覆层培养基培养3-4 d后挑取抗性转化子。1.7

19、转化子的筛选将转化子在含100 mg/mL 潮霉素B的PSA平板上连续传五代,能够稳定生长的即为阳性转化子,保存阳性转化子。1.8转化子的验证130将禾谷镰孢菌Y2021A和随机选取的6个阳性转化子的菌丝分别接入100 mL PS培养基中,25 振荡(175 r/min培养两天,收集菌丝,冷冻抽干,CTAB法29提取基因组DNA,以所提取的基因组DNA为模板,PCR扩hph片段(604bp,所用引物为hpha: GCGAAGAATCTCGTGCTTTC,hphb: GATGTTGGCGACCTCGTATT。PCR反应所用的rTaq 135DNA聚合酶购自宝生物工程(大连有限公司(TaKaRa

20、Biotechnology(DalianCo. Ltd. TaKaRa rTaq 25µL PCR反应体系:TaKaRa Taq(5 U/µL,0.125 µL;10×PCR Buffer(Mg2+ Free,2.5 µL;MgCl2(25 mmol/L,1.5 µL;dNTP Mixture(各2.5 mmol/L,2.0 µL;模板 DNA,约1.0 ng;引物1(20 µmol/L,0.5 µL;引物2(20 µmol/L,0.5 µL;蒸馏水定容至25µL。PCR反应

21、条件:94 5 min; 94 30 s, 60 30 s,72 30 s,35 cycles; 72 14010 min; 12 for ever.2结果与分析2.1酶解材料对原生质体产量的影响不同的酶解材料其原生质体产量相差很大,用幼殖体制备原生质体,其产量远远超过以菌丝体和分生孢子为酶解材料制备的原生质体(表1,因此幼殖体是制备禾谷镰孢菌原生145质体的最佳材料。表1不同的材料对原生质体产量的影响Tab.1 Effect of different material on protoplasts yield材料(Material原生质体产量(Protoplast yield(107/mL菌

22、丝(Mycelia0.87 ± 0.12bB a分生孢子(Conidiophore0.06 ± 0.02cC幼殖体(Germlings 4.27 ± 0.53aAa 采用LSD法分析了数据间的差异显著性,a:P = 0.05,A:P =0.01。a significant difference analysis according to Fishers protected LSD test. a:P = 0.05,A:P =0.01。1502.2酶组合对原生质体产量的影响在所选择的这6种酶组合中,用崩溃酶和蜗牛酶混合酶液处理幼殖体,原生质体的产量最高,可达4.36

23、×107/mL(表2。真菌细胞壁由几丁质、糖原、蛋白质、半纤维素等多种成分构成。崩溃酶是一类含有昆布多糖酶、木聚糖酶、纤维素酶的复合酶,消解细胞壁的能155力比较强,裂解酶也是一种复合酶,它具有蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶等活性,但是其酶解禾谷镰孢菌幼殖体的能力很差,这可能与禾谷镰孢菌的细胞壁结构有关。与崩溃酶相比,崩溃酶和蜗牛酶混合酶液对裂解禾谷镰孢菌幼殖体细胞壁制备原生质体具有明显的增效作用。与蜗牛酶相比,裂解酶和蜗牛酶混合酶液制备原生质体有明显的减效作用,这可能与酶之间的相互作用有关。160表2酶组合对原生质体产量的影响Tab.2 Effect of enzyme combina

24、tion on protoplast yield酶组合(Enzymes combination原生质体产量(Protoplast yield(107/mL2%D 1.79 ± 0.24bB a2%L 0.02 ± 0.005dC2%S 0.45 ± 0.13cC2%D±2%L 1.98 ± 0.37bB2%D±2%S 4.36 ± 0.67aA2%L±2%S 0.19 ± 0.06cdCa 采用LSD法分析了数据间的差异显著性,a:P = 0.05,A:P =0.01。a significant diff

25、erence analysis according to Fishers protected LSD test. a:P = 0.05,A:P =0.01。2.3酶浓度对原生质体产量的影响165用不同的酶浓度处理幼殖体时发现2%崩溃酶和2%蜗牛酶混合酶液处理幼殖体可以产生最大量的原生质体(表3。虽然高浓度酶液对原生质体有损伤作用,但是低浓度酶液对禾谷镰孢菌幼殖体的酶解作用甚微,这可能与禾谷镰孢菌的细胞壁结构有关。不同的菌有不同的合适酶浓度及其耐受酶浓度,2%崩溃酶和2%蜗牛酶混合酶液是禾谷镰孢菌的合适酶浓170度和酶组合。表3酶浓度对原生质体产量的影响Tab.3 Effect of enzym

26、e concentration on protoplast yield酶浓度(Enzymes concentration原生质体产量(Protoplast yield(107/mL1%D + 1%S 0.65 ± 0.11dC a1.5%D + 1.5%S2.68 ± 0.59cB2%D + 2%S 4.29 ± 0.62aA2.5%D + 2.5%S3.67 ± 0.57abAB3%D + 3%S 3.09 ± 0.48bcBa 采用LSD法分析了数据间的差异显著性,a:P = 0.05,A:P =0.01。a significant dif

27、ference analysis according to Fishers protected LSD test. a:P = 0.05,A:P =0.01。1752.4酶解时间对原生质体产量的影响在一个酶解体系中,原生质体的数量等于酶解产生的原生质体量减去原生质体的消解中国科技论文在线 量。用 2%崩溃酶和 2%蜗牛酶混合酶液处理幼殖体，随着酶解时间的延长，原生质体的释 放量不断增加，幼殖体的量不断减少，原生质体的消解量不断增加，当幼殖体的量减少到一 180 定程度，原生质体的释放量开始下降，当原生质体的释放量与消解量相等时，也就是酶解 1.5 h 时，原生质体的数量达到最多（图 2），1.

28、5 h 之后，原生质体的消解量大于释放量， 因此其数量开始下降。由于酶解时间过长会对原生质体有损伤作用，因此酶解 1.5 h 左右是 进行原生质体遗传转化的最好时机。 185 图 2 酶解时间对原生质体产量的影响 Fig.2 Effect of digesting time on protoplasts yield 2.5 酶解温度对原生质体产量的影响 温度对酶活性影响较大， 适宜的温度能够使其发挥正常的活性。 当酶解温度是 30 时， 190 崩溃酶和蜗牛酶混合酶液的活性最高，原生质体产量最高（图 3）。 图 3 温度对原生质体产量的影响 Fig.3 Effect of temperatur

29、e on protoplasts yield 195 2.6 幼殖体的量对原生质体产量的影响 幼殖体的量对原生质体制备的影响见图 4。每毫升酶解液中加入 0.12 g 湿幼殖体时，产 生的原生质体最多， 每毫升酶解液中湿幼殖体量超过或小于 0.12 g 时都使原生质体产生的数 量减少，因此,每毫升酶解液中应选用 0.12 g 湿幼殖体以获得最多的原生质体。 -6- 中国科技论文在线 200 图 4 幼殖体的量对原生质体产量的影响 Fig.4 Effect of the weight of germLings on protoplasts yield 2.7 转化子的筛选 从覆盖培养基上（图 5

30、）挑取转化子于在含 100 mg/mL 潮霉素 B 的 PSA 平板上，连续 205 传五代，能够稳定生长的即为阳性转化子。转化效率可达 40-50 个转化子/ g DNA 片段。 图 5 转化子 Fig.5 Transformants 210 2.8 转化子的验证 以菌株 Y2021A 和随机挑取的 6 个转化子基因组 DNA 为模板，扩增部分 hph 片段，发 现 6 个转化子都能扩增出 604bp 的 hph 片段， 而菌株 Y2021A 不能扩增出 hph 片段 （图 6） ， 这说明 hph 已插入转化子基因组中。 -7- 中国科技论文在线 215 图 6 PCR 检测转化子中 hp

31、h Fig.6 Detection of hph gene in transformants by PCR amplification. M: Marker DL2000; CK: Y2021A;1-6: Transformants. 3 讨论 原生质体制备是 CaCl2-PEG 介导遗传转化禾谷镰孢菌的关键，原生质体的数量和质量 220 更是影响转化是否成功的两大主要因素， 本研究发现用禾谷镰孢菌幼殖体为酶解材料能够制 备出足够多的原生质体， 比用菌丝体和分生孢子为酶解材料制备出的原生质体量高出 1-2 个 数量级，而且用幼殖体为酶解材料制备的原生质体进行转化，其转化效率可达到 40-50

32、个转 化子/ g DNA 片段，这在真菌的原生质体遗传转化中是比较高的转化效率。本实验室曾以 菌丝体为酶解材料制备原生质体进行转化， 但其转化效率较低， 这可能是因为菌丝的细胞壁 225 不易酶解而使其酶解不完全，得到的原生质体吸收 DNA 的能力差而使转化效率低。以幼殖 体为材料能够制备出数量多质量好的原生质体， 因此， 幼殖体是制备禾谷镰孢菌原生质体的 理想材料。本研究还确定了制备禾谷镰孢菌原生质体的最佳酶组合、酶浓度、酶解时间、酶 解温度和所用幼殖体的量。 原生质遗传转化中所用原生质体浓度要适宜。 实验中发现， 转化时所用原生质体浓度高 230 于 108/mL 时，虽然能够得到转化子，

33、但转化效率非常低；当原生质体浓度低于 106/mL 时， 几乎得不到转化子。禾谷镰孢菌原生质体遗传转化中所需原生质体的合适浓度为 107/mL。 另外，转化所用 DNA 的量不宜过多，转化子的数量与转化所用 DNA 的量并不成正比关系， 当 DNA 的量达到一定数值时，转化子的数量不再增加，而是在一个很小的范围内波动，这 可能是因为一个含有一定量原生质体的体系有一个固定的 DNA 吸收饱和值，因此，不是所 235 用 DNA 的量越多，转化子的数量就越多。 目前， 有关禾谷镰孢菌原生质体制备的报道中23,25， Novozyme 234 （InterSpex Products） 、 Drise

34、lase（Sigma）和 Chitinase（Sigma）这三种酶的混合酶解液能够制备出质量比较好的原 生质体，但是 Novozyme 234（InterSpex Products）和 chitinase（Sigma）的价格非常昂贵。 本试验用 driselase（Sigma）和 Smailase（北京百泰生化技术公司）的混合酶解液成功的制 240 备出能够进行高效遗传转化的原生质体， 对以上的酶系统进行了成功的替代。 经济高效的禾 谷镰孢菌原生质体遗传转化技术平台的建立， 为建立禾谷镰孢菌突变体文库和研究其功能基 因提供的必要的技术支持。 参考文献 (References 245 1 全国小

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