转染融合基因的DC抗肿瘤免疫效应

1、转染融合基因的DC抗肿瘤免疫效应         08-06-10 11:32:00     编辑：studa20           作者：张文彬 张海红 孔维 查晓 陈廷清 邓碧芳 任原 黄建鸣【摘要】  目的研究转染融合基因（GMCSFsurvivin GMSur）的树突状细胞(DC)在体外诱导高效而特异的抗肿瘤免疫效应。方法用jetPEITMMacrophag

2、e转染体系，将构建的GMSur融合基因转染入DC，用流式细胞仪检测DC的表面分子HLADR、CD83、CD80、CD86 表达的高低;用LDH法测定转染融合基因的DC诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)杀伤肿瘤细胞（HT29和OVCAR3）的能力。结果转染融合基因的DC细胞中可检测到GMSur融合蛋白的表达；DC表面高表达HLADR、CD83、CD80、CD86；PHA/rhIL2长期培养（21d）的T细胞CD8+比例明显增加；转染融合基因的DC对HT29肿瘤细胞的杀伤率显著高于未修饰的DC的杀伤率。结论GMSur基因转染修饰的DC能选择性诱导MHCI类分子限制的CTL的特异性，显著提高D

3、C的抗原提呈功能和诱导高效而特异的抗肿瘤免疫效应。 【关键词】  肿瘤; 树突状细胞; 融合基因; CTL；survivin；Abstract：Objective To study the specific antitumor immunological effects induced by dendritic cells transfected with GMCSF gene and survivin gene(GMSur) in vitro. MethodspcDNA 3.1 plasmid containing GMSur fusion gene was constructed

4、 and was transfected into dendritic cells by jetPEITMMcrophage transfected kit; cellular surface phenotype such as CD1a, CD80, CD86, CD83 were detected by FACS; The specific cytotoxicity of induced human cytotoxic T lymphocyte (CTLs) to tumor cells was detected with LDH assay. ResultsGMSur expressio

5、n was detected in DC cells; Highlevel expression of HLADR, CD1a, CD80, CD86, CD83 were found in transeneed DC cells; The ratio of CD8+   cells cultured with PHA/rhIL2 were largely increased. The lyse rate of induced CTL cells to HT29 cell were much higher than those of blank DC cells.Concl

6、usionGMSur gene modified DC cells could induce MHCspecific cytotoxic T lymphocytes and strikingly raised DC cell,s antigen present function and could induce high effective and specific anticancer immunological effect.   Key words：Tumor；Dendritic cell; Fusion Gene; CTL; survivin0引言surv

7、ivin基因是一种新的抗凋亡基因， 广泛表达于人的胚胎发育组织,在正常成人组织中不表达， 但在大多数肿瘤组织中表达,对肿瘤的发生、 发展起着重要作用， 是一个较为特异的肿瘤相关抗原（Tumorassociated antigen， TAA）基因1。 树突状细胞（Dendritic cell，DC）是体内重要的专职抗原提呈细胞， 直接启动和调控机体特异性的抗肿瘤免疫应答2。  粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）对DC的增殖分化、 细胞活力以及抗原提呈功能有着重要的调节作用3。 我们构建的GMCSFsurvivin融合基因表达质粒（pcGMSur）并转染人外周血来源诱导扩增的树突状

8、细胞， 探讨转染后DC的生物学特性及诱导产生的抗肿瘤免疫效应。1材料与方法1.1主要试剂pcDNA3.1(-)购自invitrogen公司。HT29细胞株、GMCSF基因由四川康龙生物医学有限公司惠赠。survivin基因由本科室从HT29细胞中克隆获得，经DNA测序与GenBank上收载的survivin序列一致。各种限制性内切酶、连接酶购自TaKaRa公司。LDH细胞毒分析盒（Cytotox96）购于Promega公司；jetPEITMMacrophage转染体系购自polyplustransfection公司、人白细胞介素4（IL4）、GMCSF购自晶美生物公司。CD1a、CD80、CD

9、83、CD86、HLADR单抗由华西医院肿瘤生物实验室提供。1.2GMCSF与survivin基因的连接以GMCSF基因DNA为模板，pGM1、pGM127为引物进行PCR扩增。以survivin为模板，Psur01、Psur02为引物进行PCR扩增。扩增DNA纯化后，BamHI内切酶37酶切2h，37 15min热终止反应，反应物纯化后加入T4DNA ligase，16连接18h。GMCSF与缺失八个氨基端氨基酸的survivin之间加入一段含三个重复氨基酸残基序列为GGGGS的肽段。利用氨基酸密码的同义突变，在连接子碱基序列的中间位置形成一个BamHI内切位点。1.3pcGMSur质粒构建

10、以上述连接物为模板，pGM1、pSur02为引物，反应条件同。反应物经纯化后，分别经EcoRI、Hind酶切。质粒pcDNA3.1(-)DNA经同样处理。酶切后纯化DNA并定量。取酶切后纯化的GMCSFsurvivin DNA  5g，pcDNA3.1(-)质粒DNA  1g，10U T4 DNA ligase，反应体系为20l。16保温20h。取连接产物10l转化感受态大肠杆菌DH52。接种氨苄青霉素平板。挑取克隆扩增培养，提取质粒，经PCR扩增初步获得pcGMSur阳性质粒。质粒经酶切电泳鉴定。  PGM1：5GCGAATTCTAGACATGGCACCCGCC

11、CGCTCGCCC3,PGM127：5CCGGATCCACCGCCACCACTCCCTCCGCCACCCTCCTGGACTGGCTC3; Psur01：5GAGGATCCGGTGGCGGAGGGAGTGGCGCCTGGCAGCCCCTTTCTC3，Psur02：5GGAAGCTTTCAATCCATGGCAGCCAGCTG3。1.4DC的诱导扩增采集健康自愿者外周血，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞层，用含20% NCS(小牛血清)的RPMI1640培养液调细胞浓度为2×106/ml，制成细胞悬液。取1ml接种与24孔板中，于5%  CO2、37孵育2h后，吸出

12、未贴壁的细胞备用。补加少许20%  NCS RPMI1640使GMCSF（1500ng/ml）和IL4（5000U/ml），终浓度分别为150ng/ml和500U/ml，置于5%  CO2、37培养，每隔一天半量换液，至第7d收集DC。分别用CD1a、CD80、CD83、CD86、HLADR单抗标记，流式细胞仪鉴定细胞表型。1.5pGMSur转染DC 收集培养7天的DC,转入12孔板培养，细胞浓度为2×105/ml，分别加入GMCSF（1500ng/ml）和IL4（5000U/ml），至终浓度分别为75ng/ml和250U/ml；再分别加入含pGMSurDNA质粒

13、和pcDNA质粒（对照）的转染液（jetPEITMMacrophage）0.1ml，24h后,收集细胞，除去转染液，继续于GMCSF和IL4条件下培养24h，收集细胞和培养上清，提取蛋白做Western blot检测。1.6转染融合基因DC转录表达的Western blot检测用甲醇氯仿法沉淀上清中蛋白。以2×SDS上样缓冲液裂解细胞,提取pGMSurDCs中蛋白和pcDNA DCs中蛋白; Western blot按常规方法进行。1.7CD8+ T细胞的诱导扩增上述未贴壁的单个核细胞悬浮于10ml  10%  NCS   RPMI1640培养

14、基中，加入适量PHA，于5%  CO2、37培养3d后，再用rhIL2诱导扩增，每隔2d换液，至21d收集细胞，分别用CD3、CD4、CD8单抗标记，在流式细胞仪上鉴定细胞表型。1.8转染GMSur融合基因DC诱导致敏CTL及其细胞毒试验上述诱导21d的CD8+ T细胞和未诱导的Naive T细胞，悬于10%  NCS  RPMI1640培养液中，调细胞浓度为2×106/ml，接种于12孔培养板内，分别加入1×105 pcGMSur、pcDNA转染和未转染的DC细胞，再加入 rhIL2至终浓度为250IU/ml，于5%  CO2、37

15、混合培养45d，作为CTL效应细胞；另取呈指数生长的H29和OVCAR3细胞，用培养液调细胞浓度至1×104/ ml作为靶细胞。效靶比按2012.51比例混合，置5%  CO2、37培养2024h。然后采用LDH法检测特异性杀伤率，并按下列公式计算特异性杀伤率：特异性细胞伤杀率(%)=效靶OD-(效应细胞自然释放OD+靶细胞自然释放OD)/(靶细胞最大释放OD-靶细胞自然释放OD)×100。2结果2.1诱导扩增DC的形态学观察及表型经淋巴细胞分离液梯度离心，从外周血获得单个核细胞，加入GMCSF、IL4培养24h后，可见有细胞由贴壁变为悬浮，并有少量细胞聚生，至第45d大量细胞聚集成团，第7d部分细胞形状不规则，高倍镜下可见有毛刺状突起，为典型的DC形态，见图1。培养第7d的DC，经FACS分析显示DC不仅表达其特异性标志CD1a（25.9%），而且高表达CD80（98.4%）、CD83（97.0%）、CD