基因克隆专题课件

1、内容概要内容概要0 基因克隆技术基因克隆技术简介简介0 基因克隆常见基因克隆常见的问题的问题与应对策略与应对策略基因克隆的基因克隆的目的目的 DNADNA的序列测定的序列测定 增加目的基因的拷贝增加目的基因的拷贝 基因功能研究基因功能研究 点突变点突变 SNP SNP分析分析网上检索引物设计DNA制备PCR扩增扩增产物纯化与克隆载体连接感受态E.coli制备转化、培养重组克隆筛选PCR或酶切鉴定测序生物信息学分析等质粒提取克隆实验的流程克隆实验的流程连接克隆分类（以连接克隆分类（以PCR产物克隆为例）产物克隆为例） 平末端连接 高保真酶一般产生的PCR产物为平末端，如Phusion DNA p

2、loymerase。 粘性末端连接 Taq酶产生的PCR产物为末端突出1个A，可采用TA克隆，非定向克隆，方法简便。 酶切连接克隆，可定向连接克隆，筛选方便。 TA克隆克隆实验中考虑的因素实验中考虑的因素 DNA的质量和浓度： 外源DNA的纯度 外源DNA的浓度与体积 载体:目的片段（摩尔比）1:31:8 防止污染： 无菌实验操作 所有试剂都要灭菌，防止外源污染基因克隆系统基因克隆系统的组分的组分基因克隆的基因克隆的几大要素几大要素 Taq、ES Taq、 Ex Taq、 Dream Taq DNA 聚合酶扩增产物为粘末端，可直接进行TA克隆 Phusion、PrimerStar、pfu DN

3、A 聚合酶扩增的产物为平末端，不能直接TA克隆，可加A处理或平末端连接 Goldstart best Taq、Taq Plus、Long Taq、Taq Platinum DNA聚合酶产物为部分加A，可直接用于TA克隆，但克隆效率比Taq酶低，建议加A处理不同不同DNA聚合酶的聚合酶的PCR产物产物目的目的DNA片段纯化片段纯化 纯化原因：多余引物、多余dNTP、多余镁离子等，可能会影响后续连接反应，建议纯化。所用洗脱液量对回收效率的影响所用洗脱液量对回收效率的影响DNA纯化常见问题及对策纯化常见问题及对策DNA纯化常见问题及对策纯化常见问题及对策凝胶无回收产物或回收率低凝胶无回收产物或回收率

4、低电泳缓冲液老化，PH值升高起始量少Washing buffer未去除干净使用去离子水进行洗脱洗脱缓冲液用量过少使用新配制的缓冲液进行制胶和电泳增加回收起始量空甩2分钟或于50度温箱中放置5-10分钟，充分去除Washing buffer最好用试剂盒配备的EB进行洗脱根据起始量使用合适体积的洗脱液回收回收DNADNA质量不好质量不好洗脱产物含有乙醇残留 洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗液残留，会使洗脱产物中含有乙醇，影响下游操作。在洗脱前可通过再次离心或置于50烤箱中510分钟，彻底去除漂洗液。DNA纯化常见问题及对策纯化常见问题及对策基因克隆的基因克隆的几大要素几大要素普通克隆普通克隆T载体载

5、体载体与片段的摩尔比载体与片段的摩尔比1:3-1:8分光光度法 受缓冲体系、样品稀释度、核酸二级结构、仪器本身等影响DNAmarker定量法 核酸染料分子插入DNA分子碱基间 50ngDNA即可显现清晰条带 定量方便直观载体与片段的摩尔比载体与片段的摩尔比1:3-1:8计算公式计算公式插入插入DNA分子量（分子量（ng）载体DNA分子量（ng）插入DNA片段长度（kb）载体DNA片段长度（kb）38基因克隆的基因克隆的几大要素几大要素T4 DNA连接酶连接酶作用机理催化相邻DNA链的5-P末端和3-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，需ATP作辅酶。本酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DN

6、A的连接，也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接。 反应条件 4 或16过夜连接体系连接体系反应条件反应体系阳性对照目的PCR 片段2 7 l4或者16过夜对照插入片段（700 bp, 50 ng/l）1 lT载体1 l1 lT4 DNA Ligase0.5-1 l0.5-1 l10Ligation Buffer1 l1 l无菌去离子水补足到10 l补足到10 l基因克隆的基因克隆的几大要素几大要素感受态细胞感受态细胞TA克隆克隆-转化转化连接产物混合冰浴30 min42度 1-2 min37度复苏培养37度过夜培养重组子的鉴定方法重组子的鉴定方法根据重组载体的抗性标志抗氨苄青霉

7、素、抗卡那霉素、lacZ基因PCR法用特定引物以转化细胞为模板进行扩增酶切法酶切，比较载体限制酶内切图谱的变化测序一般都会用测序对目的序列做最后鉴定pUC-T Vector2686 bpAPrALPHAM13RM13FP(BLA)P(LAC)ORIBamHI (418)EcoRI (397)SalI (430)HindIII (448)PstI (440)SacI (407)XbaI (424)SmaI (415)KpnI (413)pUC-T Vector4441 bpAPrgeneM13RM13FP(BLA)P(LAC)ORIBamHI (418)EcoRI (397)SalI (430)

8、HindIII (2203)SacI (407)XbaI (424)SmaI (415)KpnI (413)M13FM13R内容概要内容概要0 基因克隆技术基因克隆技术简介简介0 基因克隆常见基因克隆常见的问题与对应策略的问题与对应策略基因克隆常见基因克隆常见问题之一问题之一1.感受态细胞低效2.抗生素使用错误3.转化后立即涂板忘记温浴1.使用高效率的感受态细胞（106以上）2.复查质粒抗性，使用正确的抗生素3.转化后温浴45min左右，让抗性基因得以表达转化后无克隆产生原因原因对对策策基因克隆常见基因克隆常见问题之二问题之二1.A或T突出端丢失2.插入片段与载体比例不适 3.PCR 产物中含

9、有抑制连接的成分 4.PCR 产物已经插入，但未破坏lacZ 基因的翻译框 5.连接的PCR片段中可能有引物二聚体6.连接时间不够；温度太高1.使用新扩增的PCR产物，避免引入核酸外切酶2.与片段载体的比例：1:3-1:83.再次纯化PCR产物进行连接4.适当延长连接时间；连接温度5.过高（28）可使背景增加6.室温连接时勿超过26 白斑少原因原因对对策策基因克隆常见基因克隆常见问题之三问题之三1.未加IPTG/X-Gal或其失效2.抗生素失活，敏感菌亦能生长3.用于制备感受态的菌株退 化，丢失了某些重要因子 1.检查平板是否含IPTG/X-Gal 以及平板是否新鲜制备 2.复查抗生素的抗性3.用于制备感受态的菌株，传代次数不能太多（20代以内为佳）只有白色菌落原因原因对对策策基因克隆常见基因克隆常见问题之四问题之四1.PCR产物不纯，非目的条带亦被克隆2.PCR部分产物发生A尾丢失3.PCR所用酶不