丙型肝炎病毒感染细胞模型的研究概况

1、丙型肝炎病毒感染细胞模型的研究概况    关键词丙型肝炎病毒；培养细胞中图法分类号R373.2The establishment of cell model infected with hepatitis C virus: A revi ew丙型肝炎病毒(HCV)是输血后肝炎的重要病原体，近年来对HCV的研究日益受到重视。但 由于HCV是一种低复制病毒，实验动物及患者血清和组织中含量较少，直接研究HCV复制表达 的机制十分困难，因此迫切需要建立HCV的细胞模型。近年来，国外学者用阳性血清直接感 染、脂质体介导1、病毒载体介导2以及质粒介导3的HCV全 基

2、因序列转染细胞模型，均取得一定进展。而用血清直接感染细胞更接近自然感染的状态， 可用于研究在自然条件下病毒吸附、穿入宿主细胞的机制，以及抗体的中和作用、抗病毒治 疗等，本文就此方面做一综述。1HCV复制的细胞模型研究1.1肝细胞和肝细胞株用于HCV细胞模型1992年，Shimizu等尝试用肝细胞株建立支持HCV复制的体外模型，结果失败了。在此之后，Iacovacci等4也得出成年肝细胞及肝癌细胞株对HCV不敏感的结论，同时他 报道了用丙型肝炎病人血清感染人胎肝细胞的方法。1994年，Lanford等5用含多 种生长因子和激素的无血清培养基，体外长期培养成年黑猩猩的肝细胞，并用HCV阳性的病 人

3、血清感染培养细胞获得成功。从感染后的第4天一直到实验结束的第25天，细胞内HCV RNA 正链、负链都能测到，HCV在黑猩猩肝细胞中的复制能够被-干扰素(-INF)所抑制。It o等6用慢性丙型肝炎病人的原代肝细胞建立复制HCV体外培养系统，肝细胞用 穿刺或外科手段获得，用竞争PCR对培养细胞及培养上清中HCV RNA正、负链进行定量检测 ，证明培养的慢性丙型肝炎病人肝细胞中HCV RNA滴度一直维持在一个较高水平，负链RNA 在4周以内均为阳性。而来自肝硬化病人的两个肝细胞标本中正链HCV RNA的滴度呈下降趋势 。用1例培养细胞的上清接种到两例肝癌病人肝细胞的培养液中(此两例病人HCV A

4、b、RNA均 阴性)，培养3 d后正链RNA转为阳性，7 d后负链RNA转为阳性，细胞中正链HCV RNA的滴度从 1 02 copies/孔上升至103 copies/孔。由于释放到上清中的HCV颗粒具有感染性，证实了 原代肝细胞体外复制HCV成功。Ito等用基因测序的方法比较了培养前后HCV E2/NS1区的核 酸序列，在培养前的肝细胞中有3个主要型别和2个亚型，培养56 d内，相同的型别和同样的 比率被检测出。结果证实在体外细胞培养体系中，HCV的生物学特性没有改变。同时还用荧 光抗体方法证实了HCV主要在表达人白蛋白的肝细胞中复制。由于原代肝细胞体外长期培养非常困难，细胞分化能力有限，

5、不能多次传代，限制了其 在HCV体外复制模型中的应用和研究。而有关人肝细胞株培养HCV的报道甚少，直到1996年Ka to等7才报道应用非肿瘤形成的人肝细胞系PH5CH培养HCV获得成功。实验用2个 HCV RNA阳性的献血员血清(编号IB-1、IB-3)分别接种在PH5CH细胞培养液中，用半定量PC R方法检测细胞及上清中HCV RNA，结果在30 d内PH5CH细胞中HCV RNA呈增加趋势，证实了在 这 个培养系统中HCV能够复制。同时Kato等用基因测序的方法分别检测了接种血清和培养细胞 中HCV HVR1，在细胞中检测出有不同于IB-1的2个变异株；在IB-3中有6个相似株，而在其

6、接种的细胞中只检测到了其中1个。研究者认为这些实验结果都充分证实了HCV在细胞中的复制。1.2淋巴细胞系用于HCV细胞模型1985年Helling等8首次报道了由于输注白细胞，使黑猩猩感染上丙型肝炎， 推测淋巴细胞可携带HCV。根据这一结论，部分学者开始转向淋巴细胞的筛选。1992年Shimi zu等9用鼠逆转录病毒感染人T细胞，得到MOLT-4细胞株，报道了当鼠逆转录病 毒和HCV共同感染人T细胞时，HCV在细胞中复制效率大大提高。用cDNA/PCR的方法检测HCV R NA，在接种3周后的培养细胞中HCV RNA仍为阳性；用32P标记的特异的RNA探针作杂交 实 验，证明培养细胞中负链HC

7、V RNA的存在；同时通过免疫荧光的方法，用抗HCV Core和NS4的 特异抗体证实了感染7 d后培养细胞中有HCV抗原表达。Shimizu将这种用鼠逆转录白血病病 毒 感染的人T细胞株命名为MOLT4-M细胞株。这一实验的成功，为研究人T淋巴细胞作为HCV体 外复制的细胞模型奠定了基础。1993年Shimizu等10再次报道了用鼠逆转录病毒 感染人T细胞，获得了HPB-Ma细胞株，并用有限稀释法获得HPB Ma 10-2克隆，可有效支持 HCV复制。最长培养至76 d，细胞中仍能检测到负链HCV RNA；用免疫荧光法证实了HCV抗原 在 培养细胞中的表达。虽然HCV基因组在细胞中可存在10

8、周以上，有力地证实了病毒的复制， 但不十分清楚这一系统是自然夭折还是能产生有感染性的病毒。为回答这一问题，Shimizu 等11构建了新霉素抗性和匀霉素抗性的受体细胞，分别命名为ADneo细胞株和Mah ygr细胞株。将用感染HCV的HPB-Ma 10-2细胞与耐药的受体细胞共同培养，然后用抗生素 选择培养受体细胞，通过此方法检测出HCV可从感染细胞多次转给受体细胞，证明HPB-Ma细 胞在体外可产生有感染性的病毒颗粒。Shimizu等在此模型的基础上，进行了大量有关HCV生 物学，免疫学方面的研究，得出了许多有价值的结论1114。其中一个重要实验 是用一个含相似株(含6种不同的HVR1核酸序

9、列)的丙型肝炎病人血浆，分别接种黑猩猩和HPB -Ma 10-2等人淋巴细胞株。感染结果显示，相同的2个相似株在体内、体外感染中均出现 ，而其余4株均未出现。Shimizu等认为接种物中存在与某些相似株结合的中和抗体，阻止了 这些相似株感染黑猩猩和细胞。除此之外还有一些学者应用不同的淋巴细胞系培养HCV，其 中有Kato等15报道的MT-2细胞株以及Nissen等16报道的H9细胞株， 均能在体外复制HCV达2周以上。以上所应用的细胞系均来自人的T细胞。有关B淋巴细胞的应用，文献报道的较少，Bertolini等17和Valli等 18有限的几篇报道，都是应用从正常人骨髓细胞中分离出来的B淋巴细

10、胞株，这些B细胞 在体外能较长时间复制HCV。Bertolini等应用的CE细胞株，在培养长达65 d后仍能用PCR和 免疫荧光方法证实HCV的存在。而Valli-应用的TOFE细胞则可支持HCV复制长达6个月以上。 Shimizu等13用Daudi细胞株培养HCV，并用免疫电镜技术在培养15 d的Daudi细胞 浆中发现了直径大约50 nm的病毒颗粒和与HCV感染相关的细胞浆管型样结构。根据Nakajima 等19报道，HCV在HPB-Ma 10-2及Daudi细胞中系列转染可产生有感染性的HCV长 达1年，病毒复制的基因组浓度可达104/ml以上。在培养过程中，共产生13株突变株，其 中4

11、个突变株的HVR序列与被同一接种物感染的黑猩猩外周血单个核细胞(PBMC)中的HCV HVR 序列一致，而该序列与黑猩猩肝组织和血清中HCV HVR序列不同，推测HCV变异可能在PBMC 中首先发生。根据目前资料，淋巴细胞是建立HCV感染细胞模型的最佳选择，尤其是淋巴细胞株可在 体外长期培养，能有效地支持HCV的复制，并能产生有感染性的病毒颗粒。1.3其它细胞用于HCV细胞模型除肝细胞和淋巴细胞外，用其他细胞培养HCV的报道少。1994年Zibert等20 ，报道了用人纤维母细胞VH3细胞株建立HCV感染模型，VH3细胞支持HCV复制最长可达3周。Z ibet等在此模型基础上，建立了分析抗体中

12、和作用的方法，认为抗HCV HVR1区的抗体具有中 和作用，并且不是所有HVR1的抗体是绝对结构特异的，不同相似株之间可以产生抗原-抗体 的交叉反应。2存在的问题HCV体外细胞培养的研究虽然取得了较大进展，但仍然没有达到能够实际应用的目标， 具体分析可能有以下原因：许多研究表明随着培养时间的延长，已感染HCV的细胞经 过几代后容易丢失，可能是HCV在细胞内的生长繁殖受到培养细胞内外环境的限制。目前H CV长期培养在肝细胞及肝细胞株中并未获得成功，而在T、B淋巴细胞中长期培养的HCV，其 生物学特性是否已发生改变，尚需进一步研究。虽然在HPB-Ma及Daudi细胞中找到了直径 为50 nm的病毒

13、颗粒，其密度大大高于黑猩猩肝组织中的密度。为什么在非肝细胞中的病毒 颗粒比肝细胞中更多见，这些颗粒是否是成熟的HCV，这些问题尚需更深入的研究。参考文献1Yoo B J, Selby M J, Choe J, et al. Transfection of a differ entiated human hepatoma cell line (Huh 7) with in vito-transcribed hepatiti s C vrius (HCV) RNA and establishment of a long-term culture persistently infec ted wit

14、h HCV. J Virol,1995,69(1):322Dubuisson J, Hsu H H, Cheung R C, et al. Formation and intracellula r locallization of hepatitis C virus envelope glycoprotein complexes expressed b y recombinant vaccinia and Sindbis viruses. J Virol,1994,68(6):61473Mizuno M, Yamada G, Tanaka T, et al. Virion-like struc

15、tures in HeL a G cells transfected with the full-length sequence of the hepatitis C virus ge nome. Gastroenterology,1995,109(3):19334Iacovacci S, Sargiacomo M, Parolini I, et al. Replication and multi plication of hepatitis C virus genome in human foetal liver cell. Res Virol,1993 ,144:2755Lanford R

16、 E, Sureau C, James R, et al. Demonstration of in vitro in fection of chimpanzee hepatocytes with hepatitis C virus using strand-specitic RT-PCR. Virol,1994,202:6066Ito T, Mukaigawa J, Zuo J, et al. Cultivation of hepatitis C virus in primary hepatocyte culture from patients with chronic hepatitis C

17、 results in release of high titre infections virus. J Gen Virol,1996,77(5):10437Kato N, Ikeda M, Mizutani T, et al. Replication of hepatitis C viru s in cultrued Non-noplastic human hepatocytes. Jpn J Cancer Res,1996,87(8):787 8Hellings J A, Van Der Veen-Du J, Snelting-Van Densen R, et al. Pr elimin

18、ary results of transmisson experiments of Non-A, Non-B hepatitis by mono nulear leycocytes from a chronic patient. J Virol Methods,1985,10(1):3219Shimizu Y K, Iwamoto A, Hijikata M, et al. Evidence for in vitro replication of hepatitis C virus genome in a human T-cell line. Proc Natl A cad Sci USA,1

19、992,89(6):547710Shimizu Y K, Purcell R, Yoshikura H. Correlation between the i nfectivity of hepatitis C virus in vivo and its infectivity in vitro. Pr oc Natl Acad Sci USA,1993,90(5):603711Shimizu Y K, Yoshikura H. Multicyele infection of hepatitis C viurs in cell culture and inhibition by alpha an

20、d beta interferons. J Virol Dec,1994,68( 4):840612Shimizu Y K, Hijikata M, Iwamoto A, et al. Neutralizing Antibodies against hepatitis C virus and the emergence of esape mutant viruses. J Virol Ma r,1994,68(3):149413Shimizu Y K, Feinstone S M, Kohara M, et al. Hepatitis C virus: de tection of intrac

21、ellular virus partides by electron microscopy. Hepatoogy,1996,2 3(1):20514Hjikata M, Mizuno K, Rikihisa T, et al. Seletive transmission of h epatitis C virus in vitro and in vivo. Arch Virol,1995,140(3):162315Kato N, Nakazawa T, Mizutani T, et al. Susceptibility of human T- lymphotropic virus type I infected cell line MT-2 to hepatitis C virus infectio n. Biochemical and Biopysical Research Communications,1995,206(2):86316Nissen E, Hohne Maria, Schreier E. In vitro replication of