病原细菌的形态检查.

1、职业教育现代宠物技术教学资源库病原细菌的形态检查【训练目标】学会细菌染色标本片（抹片）的制备和几种常用的染色方法。【仪器与材料】（1）器材载玻片、接种环、眼科镊子、显微镜、酒精灯、火柴、香柏油、二甲苯、吸水纸、凹玻片、盖玻片（22mm×22mm）、生理盐水、 95%酒精、冰醋酸、各种染色液等。（2）病料【学习内容与步骤】（1）细菌标本片的制备玻片准备载玻片应清晰透明， 洁净而无油渍， 滴上水后，能均匀展开，附着性好。如有残余油渍，可按下列方法处理：滴 95%酒精 23滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯外焰上轻轻拖过几次。若仍不能去除油渍，可再滴 1 2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯外

2、焰上轻轻拖过。抹片制备抹片所用材料不同，抹片方法也有差异。液体材料 ( 如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等 ) 可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。非液体材料 ( 如菌落、脓、粪便等 ) 则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料， 在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。组织脏器材料可先用镊子夹持中部，然后以灭菌或洁净剪刀取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上压印 ( 触片 ) 或涂抹成一薄层。如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，亦可在同一张玻片上有秩序地排好， 做多点涂抹，或者先用蜡笔在玻片上划分成若干小

3、方格，1职业教育现代宠物技术教学资源库每方格涂抹一种样品。干燥干燥上述涂片应让其自然干燥。固定固定有两类固定方法。火焰固定：将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖过数次，略作加热( 但不能太热，以不烫手为度) 进行固定。化学固定：血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色，不用火焰固定，而用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入甲醇中 23min，取出晾干；或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用 23min，自然挥发干燥，抹片如做瑞氏染色，则不必先做特别固定，瑞氏染料中含有甲醇，可以达到固定的目的。固定目的：杀死细菌；使菌体蛋自凝固附着在玻片上，以防被水冲洗掉；改变细菌对染料的通透性，

4、因活细菌一般不允许染料进入细菌体内。（2）细菌标本片的染色只应用一种染料进行染色的方法称简单染色法，如美蓝染色法。应用两种或两种以上的染料或再加媒染剂进行染色的方法称复杂染色法。复杂染色法染色后不同的细菌或物体，或者细菌构造的不同部分可以呈现不同颜色，有鉴别细菌的作用，又可称为鉴别染色，如革兰氏染色法、瑞氏染色法和姬姆萨染色法等。 美蓝染色法在已干燥固定好的抹片上， 滴加适量的 ( 足够覆盖涂抹点即可 ) 美蓝染色液，经 12min，水洗，干燥 ( 可用吸水纸吸干，或自然干燥，但不能烤干 ) ，镜检。菌体染成蓝色。 革兰氏染色法在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫溶液，经 1 2min，

5、水洗；加革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用 1 3min，水洗；加 95%酒精于抹片上脱色，约 0.5 1min，水洗；加稀释的石炭酸复红 ( 或沙黄水溶液 ) 复染 102职业教育现代宠物技术教学资源库30s，水洗；吸干或自然干燥，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。瑞氏染色法抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于其上，为了避免很快变干，染色液可稍多加些，或看情况补充滴加；经 13min，再加约与染液等量的中性蒸馏水或缓冲液，轻轻晃动玻片，使之与染液混合，经 5min左右，直接用水冲洗 ( 不可先将染液倾去 ) ，吸干或烘干，镜检。细菌染成蓝色，组织细胞细胞浆呈红色，细胞核呈蓝色。姬姆萨染色法抹片甲醇固定并干燥后， 在其上滴加足量染色液或将抹片浸入盛有染色液（于 5ml新煮过的中性蒸馏水中滴加 5 10滴姬姆萨染色液原液，即稀释为常用的姬姆萨染色液）的染缸中，染色 30min，或者染色数小时至 24h，取出水洗，吸干或烘干，镜检。细菌呈蓝青色，组织细胞细胞浆呈红色，细胞核呈蓝色。（3）细菌标本片的观察