分子生物学试验步骤总结超全

1、 一目的基因的获得 细菌基因组DNA勺提取 （一）仪器 1）台式高速离心机 2）恒温水浴箱 3）枪式移液器 4）灭菌的EP管和Tip头 （二）试剂 1）溶液1:25% 50mmol/L 50mmol/L 500ug/ml 100ug/ml 2）溶液H:100mmol/L 1% 400ug/ml 3）酚：氯仿：异戊醇（25: 4）氯仿：异戊醇（24:1） 5） 3mol/LNaAc（pH5.2） 6）异丙醇或无水乙醇 7） 70%乙醇 8） TE缓冲液：10mmol/L 1mmol/L （三）实验步骤 1） 5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。 2）将菌体细胞悬于250uL

2、溶液1中，37 C水浴保温过夜。 3）力口250uL溶液H,550C水浴彳温4小时。 4）加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）,轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。 5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24:1）,轻轻混匀，于14000rpm离心10 蔗糖 Tris-Hcl,pH8.0 EDTA,pH8.0 溶菌酶（现用现配） RNase Tris-Hcl,pH8.0 SDS 蛋白酶K 24:1） Tris-Hcl,pH8.0 EDTA,pH8.0 分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。 6）向转移的水相中加入0.1

3、倍体积的3mol/LNaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无 水乙醇），冰上放置30分钟。 7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。 8）将DNA沉淀溶解于15ulTE缓冲液中，-20C保存。 9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。 植物DNA的SDS提取法： （一）试验试剂： 1）研磨缓冲液：称取59.63gNaCl,13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTANa分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0,并定容至1000ml。 2） 10SSC容液：称取87.66gNaCl和44.12g

4、柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。 3） 1SSC容液：用10SSC容液稀释10音。 4） 0.1SSC容液：用1SSC容液稀释10倍。 5） RnasefS:用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl,pHU5.0,使用前经80c水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase。 6）氯仿异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。 7） 5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4.H2O70.23g,先加入少量蒸储水溶解再容至100ml。 8） SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在7080c的水浴中

5、溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。 9） 1mol/LHCl。 10） 0.2mol/LNaOH。 11）二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液浓乙醛：H2O=1:50（V/V）。 12） 1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。 13） 0.05mol/LNaOH。 14） DNA标准液：取标准DNA2mg溶于少量0.05mol/LNaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml,后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，力口5.0ml1mol/LHClO4,混

6、合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100g/ml的标准溶液。 （二）实验步骤： 1）称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS,置冰浴上研磨成糊状。 2）将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，加上塞子，剧烈 振荡30s,转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。 3）离心形成三层，小心地吸取上层消液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。 4）将试管置72c水浴中保温3min（不超过4min）,以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，力口5m

7、ol/L高氯酸钠溶液提取液：高氯酸钠溶液=4:1（V/V）,使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。 5）再次加入等体积氯仿-异戊醇混合液至大试管中，振荡1min,静置后在室温下离心（4000rpm）5min,取上清液置小烧杯中。 6）用滴管吸95%的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上消液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。 7）然后加入0.5ml左右的10SSC,使最终浓度为1SSC 8）重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。 9）加入已处理的Rnase容液，使其最后的作用浓度为5070仙g/ml并在37c水浴中保温 30min

8、,以除去RNA。 10）加入等体积的氯仿异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min,再除去残留蛋白质及所加 Rnaset白，室温下以4000rpm离心5min,收集上层水溶液。 11）再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。二、PCfT增目的基因 （一）器材 1）微量移液器 2）灭菌的Tip头、PCR管 3）PCR扩增仪 4）目的DNA（DNA模板） 5）dNTP混合物 6）引物对 7） Tap# 8） PCR扩增试剂盒 （二）试剂 1） 10XPCR缓冲液（含Tris-HCl100mmol/L;MgCl215mmol/L、KCl500mmol/L,pH8.3, 0.1%明胶） 2）脱氧核甘三磷酸

9、dNTPs：配成10mMdATP,dTTP,dGTP,dCTP各10mM，用NaOH溶液调节至pH8.3o） 3）氯仿-异戊醇：配成24:1的比例，室温避光保存。 4）酚：氯仿：异戊醇=25:24:1 5）3MNaAc、ddH2O 6）无水乙醇：70%L醇 7）TE缓冲液 （三）实验步骤 1）在0.2ml薄壁反应管中加入下列成份：（混匀） ddH2O:补至终体积（25 10XPCR冲液1/10总体积 2.0mMdNTPs11 2U/履TaqDNAK合酶0.51 引物混合液（10pmol/M引物）1膜 DNA模板0.6仙 1 混匀后，在台式离心机上瞬时离心10秒。 2）在设定好的PCR仪上反应

10、95,5min；95 C,1min；56 C,1min；72,2min。反应30轮。 3)反应结束后，将反应管在72充分延伸10分钟，再将反应管冷却至40取一部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳(实验三)，确认是否有目的的PCR产物。如果PC*物纯度较低或反应液中含有连接反应阻碍物，可以通过纯化得到改善。纯化继续4)6)。 4)转至1.5ml离心管，向管中加25小酚，25小氯仿-异戊醇混匀，离心10000rpm,30秒。 5)吸取上层液，转至另一已加53MNaAc的1.5ml的离心管，加150仙无水乙醇，-20 C过夜。 6)离心10000rpm,10分钟，弃上清，力口0.5ml70%JI,10000

11、rpm离心，5分钟。弃上清， 烤箱中干(60 C),溶于20仙lTE (四)技术要点 1)PCR各组份的配制与加样量要特别注意。 (1)引物浓度：10pmol足够30个循环，浓度太高导致与模板非特异结合增强，扩增非特异片段增多，浓度太低则扩增效率低。 (2)引物的配制：厂家提供的引物一般是干粉状态并标明OD值，1OD约含33小开盖前先将干粉离心至管底，加双蒸水至浓度2Ng/从再取部分稀释至10pmol/汐1引物浓度计 算公式：1pmol=(3.3x10仙)xn,n是引物的碱基数 (3)Mg2+:使用浓度一般在1.5mM,要求模板不含高浓度EDTA和诸如硫酸基团类的负电 2+ 荷基团，Mg浓度升

12、高可导致错配率升高和非特异性扩增。 (4)模板DNA:浓度不可过高，质粒DNA20ng即可，若需第二次扩增，可将第一次扩增产物稀释1000-10000倍作为模板使用。 (5)TaqDNA聚合酶：一般用量5U/100屋酶量过大易导致扩增非特异序列，Taq酶具有 末端转移酶活性，常在3端加A。 2)扩增轮数与退火温度 6 扩增轮数：一般30轮以内就可使模板扩增10倍，超过30轮，错配率升高。 退火温度计算公式：Tm值=(GCX4+ATX2)-4 三、琼脂糖凝胶电泳的检测 （一）仪器 1）琼脂糖凝胶电泳系统（天平、锥形瓶、量筒、微波炉、凝胶板、梳子、枪式移液器、 灭菌Tip头、水平电泳槽、电泳仪）

13、2）凝胶成像仪 （二）试剂及材料 目的DNA琼脂糖、蔗糖、澳酚蓝、硼酸、Tris、EDTA、EB、DNA纯化试剂 盒 1）TAE电泳缓冲液 浓储存液50 x：242gTris；57.1ml冰乙酸；100ml0.5mol/LEDTA（PH8.0） TH谷至升o 使用液1x：4.84gTris；1.15ml冰乙酸；2ml0.5mol/LEDTA（PH8.0） TH谷至升o 2）样本液 10X缓冲液：60%蔗糖；0.4%臭酚蓝 （三）实验步骤 1）将有机玻璃内槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，插好梳子，在梳子底部与胶槽之间应保持几毫米的间隙。 2）0.8%琼脂凝胶板白配制：取0.6g琼脂糖力口80m

14、lTAE（1X）,20ml水，微波炉加热融化3分钟，将其冷却至550C-650C,加入EB储存液1ul,小心混匀，缓慢倒入制胶槽中。（根据目的基因的大小选择琼脂糖凝胶浓度）。 3）充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（1X）,使其液面略高于 琼脂糖板，拨出样品梳。 4）DNA样品按照10:1的比例加入样本液，在腊面纸上混匀，用移液枪加样于琼脂糖板的样品孔中。同时另取一个DNA分子量标准上样于另一样品孔，在同一凝胶板上进行电泳。 5）接通电泳槽与电泳仪的电源，维持稳压1-5V/cm（按照两极之间距离计算），电泳时间根据澳酚蓝指示剂迁移的位置来判断，当移动到距凝胶前沿1-2cm出

15、停止电泳。 6）剥胶并在凝胶成像仪观察结果。 （四）技术要点 1）选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA勺大小，小片段DN而用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在1%勺琼脂糖凝胶中澳酚蓝的泳动速度与500bp的双链线状DNAr致。 不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性DNAk小范围见下表1。 表1不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性DN期子的有效分离DNA勺有效范围（kb）范围凝胶浓度（为 0.3605 0.6201 0.8100.8 1.1 70.5 1.2 60.4 1 30.2 20.1 2）电泳中注意防止凝胶发热。 3）将电泳仪置稳压档，电压设置小于5V/cm（电极间的最小路径）。随着电压的增加

16、，琼脂 糖凝胶的有效分离范围缩小。 4）澳化乙锭有强烈的致癌作用，操作时注意防护。四、目的DNA勺回收纯化 （一）仪器 1）琼脂糖凝胶电泳系统 2）凝胶成像仪 3）离心机 4）单面刀片 5）恒温水浴锅 （二）试剂 DNA回收试剂盒 50XTAE ddH2O （三）实验步骤 1）在紫外灯下切分含DNA勺琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖.放入1.5ml离心管中。 2）按每100mg琼脂糖力口入300600屋溶胶液的比例加入溶胶液（本实验加500ul）,置55c水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。 3）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm室温离心1分钟，倒掉收集

17、管中的液体.再将吸附柱放入同一个收集管中。 4）在吸附杜中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后，12000rpm室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 5）再在吸附柱中加入500uI漂洗液，12000rpm室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 6）12000rpm室温空离心1分钟。 7）将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后，12000rpm室温离心1分钟 （为提高回收效率可再洗脱一次） ， 将1.5ml离心管（DNA）贮存于-20C。五、限制性内切酶消化、产物回收及连接重组 （一

18、）仪器及材料 1）回收得到的目的DNA BamHI、Hindlll、T4DNA连接酶、DNA回收试剂盒 pUC18-CAT质粒、双蒸水、10X酶切通用缓冲液K EP管、恒温水浴锅、微量移液器、台式离心机 表1常用酶切缓冲液配方 缓冲液名称 10XL 配方 100mMTris-HCl,pH7.5 100mMMgCl2 贮存温度（C） -20 10XM 10mMDll 100mM Tris-HCl,pH7.5 -20 100mMMgCl2 10XH 10mMDTT 500mMNaCl 500mM Tris-HCl,pH7.5 -20 100mMMgCl2 10XK 10mMDTT 1000mMNa

19、Cl 200mM Tris-HCl,pH8.5 -20 100mMMgCl2 10XT(BSAFree) 10mMDTT1000mMKCl 330mMTris-Ac,pH7.9 100mMMgAc 5mMDTT 660mMKAc -20 0.1%BSA 0.1%TritionX-100-20 -20 （二）实验步骤 1）在灭菌的EPt中按如下方式准备双酶切反应体系: 酶切反应体系（20ul体系） F核酸10 x酶切通用缓冲液 K ddH2O BamHI HindIII 1 15ul目的DNA2ul 0ul 2ul 1ul 2 10ulpUC18-CAT质粒2ul 5 ul 2ul 1ul 2）

20、37C保温三小时。 3）酶切产物的纯化回收，每100ul溶液加入700ul溶胶液，其余的操作步骤详见实验四 4）载体与目的DNA的连接。在灭菌的EPt中按如下方式准备双酶切反应体系（20ul）: 目的DNApUC18-CAT质粒10X连接缓冲液T4DNA连接酶ddH2O XulYul2ul1ulZul 目的DNA和pUC18-CAT质粒的相对浓度约为1:31:10 14c水浴保温过夜。六、大肠杆菌感受态细胞的制备及目的DNA的转化 （一）仪器 .小型高速离心机 .恒温摇床 .恒温培养箱 .-20c冰箱 .恒温水浴器 .超净工作台 .局压火菌锅 （二）材料 .氨苇青霉素 .大肠杆菌DH5a .连

21、接产物 .离心管 .枪头、微量移液器 .试管、培养皿、三角瓶 （三）试剂 LB培养基（根据需要确定配制的量）： 10g/L胰蛋白陈，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl,加水至1000ml,高压灭菌，保存在室温。 氨苇青霉素： 用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，20c分装保存。 卡那霉素： 用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，20c分装保存 无抗生素LB脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）： 10g/l胰蛋白陈，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl,15g/l琼脂粉，加水至1000ml,高压灭菌； 铺平板，冷却后在37c培养24小时，保存在室温。 含有抗生素

22、LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）： 10g/l胰蛋白陈，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl,15g/l琼脂粉，加水至1000ml,高压灭菌； 当培养基降温至50c左右，加入终浓度为100g/ml的氨苇青霉素或50仙g/m、那霉素，并铺平板，冷却后在37c培养24小时，保存在室温 0.1MCaCl2（根据需要确定配制的量）： 11.099克溶解在1000ml灭菌水中，0.22小碗器过滤除菌。氯化钙分子量为：110.99。 50%甘油： 50ml甘油加入50ml水，混匀，高压灭菌。 其他： DH5a大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干，接菌环，加250mlLB液体培养基的1000ml灭菌锥形

23、瓶一个，灭菌50ml和500mL离心管若干，灭菌刻度吸管若干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头,灭菌Eppendorf管等。 （四）实验步骤 1）以接菌环从-70c保存的高效转化菌种中蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12小时；2）挑取单菌落接种于5mL无抗生素LB养基中，37c振荡培养过夜； 3）按照1:100接种菌液至250mLLB培养基中，37c剧烈振荡培养1.5-2小时左右，至OD600达0.4-0.6; 4）将菌液冰浴10分钟，转移至预冷的500mL离心管中，4C,4000rpm离心10分钟； 5）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于50mL预冷的0.1MCaCl2中，冰浴20分钟，4C,4000

24、rpm离心10分钟； 6）弃尽上清。以12.5mL（菌液体积的5%）预冷的0.1MCaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入等体积预冷的50%t油水溶液，曰M匀后按每支50仙在冰上分装，-80c保存；注：以上操作全部在无菌条件下进行。 7）取连接产物2（在实际操作中，经常需要取全部连接产物）置于冰上； 8）从80C冰箱取3管感受态细菌（每管50）1,在冰上融化； 9）将连接产物加入感受态细菌中，混匀，放置冰上20-30分钟；同时做两个对照管 ?受体菌对照：50仙感受态细胞+2以无菌水 ?质粒对照：500.1MCaCl2溶液+2以连接产物 10）42c加热90秒，迅速置于冰上12分钟； 11）每管加入

25、4001000N的无抗生素液体LBW养基，在37c摇床缓慢摇荡2060分钟；12）用10000rpm离心10秒，弃去大部分上清，留下约50仙并用移液器吹吸重悬细菌；13）取适量细菌悬液均匀的涂布在带有相应抗性（根据质粒所携带抗生素抗性基因而定）的LB脂糖平板上，倒置于37c培养多!培养12小时以上，出现菌落。 （五）技术要点 .加入的连接产物体积应该小于感受态细胞体积的5%; .42c热激时，必须要保证温度的准确性； .涂布LEff板的菌液量应该根据经验确定。如果连接效率很高，而且所用感受态细菌的效率也很高，则吸取较少量的菌液；反之，可以增加，甚至全部菌液涂布平板。判断的标准：在LB平板上生长

26、密度合适的单菌落； .涂布平板之后，在37c培养的时间不超过12-16小时，否则可能产生卫星菌落； .防止其它质粒污染； .防止其它细菌污染。七、质粒DNA的提取及重组子的鉴定 （一）仪器 .恒温培养箱 .恒温摇床 .小型高速离心机 .高压灭菌锅 .分光光度计（二）试剂及材料 .转化重组子 .缓冲液A:50mM葡萄糖；10mMEDTA;25mMTris-HCl,pH8.0。 .碱溶液：0.2MNaOH;1%SDS,PH12.5。 .乙酸缓冲液：3MNaAC;2M乙酸，pH4.8（盐酸调pH）。 .TE缓冲液：10mMTris-HCl,pH8.0;1mMEDTA.。 .RNA酶A溶液：10mg/mlRNA酶A,用TE配制，100 C煮10分钟，灭活DNA酶。缓慢冷却至室温，10000r/min离心5min,上清于-20 C保存。 .LB培养基：10g胰蛋白陈，5g酵母粉，5gNaCl加水至1000ml,用1MNaOH调pHS7.5,局压火困。 .氨苇青霉素：用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，20c分装保存。 .LA培养基：在LE养基中加入终浓度100叱g/ml氨苇青霉素。