分子诊断知识点

1、1、基因（gene）是含有生物信息的DNA功能片段，根据这些生物信息可以编码具有生物功能的产物，包括RNA和蛋白质（多数）.2、基因组genome,指细胞或生物体一套完整的遗传物质，包括所有基因和基因间的区域（序列）。3、基因组学genomics以基因组为研究对象的一门学科，包括基因组作图、基因组测序、基因定位、基因功能分析4、结构基因：编码RNA或蛋白质的核甘酸序列5、基因表达：DNA携带遗传信息通过转录传递给RNA,mRNA通过翻译将基因的遗传信息在细胞内合成具有生物功能的各种蛋白质的过程6、C值基因组DNA全部碱基（对）数。C值是物种的一个重要特性常数。C值矛盾，C值悖论：生物体的进化程

2、度与基因组大小之间不完全成比例的现象7、N值矛盾，N值悖论：基因组中的基因数目与生物进化程度或复杂程度的不对称性8、必需基因（致死基因）关系到生物体存活的基因。可通过基因突变实验确定必需基因。：9、原核生物基因组1、细菌、支原体、立克次体、衣原体、螺旋体、放线菌、蓝绿藻等10、重叠基因：是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列为两个或两个以上基因的组成部分。11、操纵子：由一组功能相关的结构基因连同其上游调控序列共同组成一个转录单位12、质粒的分类致育质粒F质粒）编码性菌毛，介导细菌之间的接合传递；耐药性质粒R质粒）编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性；毒力质粒Vi质

3、粒）编码与该菌致病性有关的毒力因子；细菌素质粒编码细菌产生细菌素；代谢质粒编码产生相关的代谢酶。13、严紧控制型拷贝数少，一般10个，分子量大；调节因子是蛋白质，复制受限，受染色体DNA复制系统的控制；严谨控制机理（低拷贝原因），认为是该质粒可以产生阻遏蛋白，反馈抑制自身DNA合成。松弛控制型拷贝数多，10-200个，分子量小；调节因子是RNA,复制不受染色体DNA复制系统限制基因工程使用松弛型（高拷贝数）质粒，以获得较多的基因产物。14、质粒性质1、质粒的转移：可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个细菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可

4、以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。2、质粒具有选择性标记：质粒有抗药性基因、营养缺陷型基因、抗重金属盐基因等多种选择性标记3、质粒的不相容性：质粒已成为分子克隆的有用工具，是目的DNA的载体。载体质粒大多是在天然质粒基础上经人工构建而成，15、质粒特点：1、有限制性核酸内切酶单一切口，可用以重组外源DNA;2、有筛选标记，如抗药基因等；3、插入外源DNA后，仍能转化宿主细胞，并能复制。16、质粒基因转移的方式1.接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DN从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用2.转化作用通过自动获取或人为地供

5、给外源DNA,使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用3、转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用4、转染作用通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染（transfection）。转染是转化的一种特殊形式。17、完整的病毒颗粒包括：衣壳、基因组（DNA或RNA）、被膜、病毒颗粒中的其他内容物18、病毒分段基因组：流感病毒属分段RNA病毒：意义：a）降低包装压力b）降低了造成断裂的可能性，提高编码能力c）有分段基因组的病毒一般感染效率较低，只有全部基因

6、组核酸片段存在时，病毒才具有感染能力。植物病毒d）由于分段基因组易发生重组，故病毒容易变异。19、病毒基因组特点：1、有特殊的末端序列：粘性末段、反向互补序列、长末端重复序列、帽和尾结构等；2、结构紧密，体现在不仅非编码序列少，而且有重叠基因的存在；真核生物20、染色体的包装：（1）染色体的一级结构一核小体（2）染色体的二级结构一螺线管3）染色体的三级结构一超螺线管（4）染色体的四级结构一染色单体21、真核生物染色体基因组一般特征1、真核生物的基因组比较庞大；2、线性双链DNA和三种：1、反向重复序列2、卫星DNA由于这类序列的碱基组成不同于其他部份，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开，

7、因而称为卫星DNA（或随体DNA）3、较复杂的重复单位组成的重复顺序中度重复顺序：依据重复顺序的长度，中度重复顺序可分为：短散布元件和长散布元件Alu家族是哺乳动物基因组中含量最丰富的一种中度重复顺序家族（短分散元件），Alu家族每个成员的长度约300bp,每个单位长度中有一个限制性内切酶AluI的切点（AGJCT）,Alu可将其切成长130和170bp的两段，因而定名为Alu序列（或Alu家族）24、断裂基因（splitgene）:真核生物的结构基因，由若干个编码区和非编码区相间隔但又连续镶嵌而成，为一连续的氨基酸组成的完整的蛋白质编码，或为具有特殊功能的tRNA或rRNA编码，因此称为断裂

8、基因。并非真核生物所有的结构基因均为splittinggene例：组蛋白基因家族、干扰素、酵母中多数基因25、线粒体DNA的遗传特性：母系遗传、突变率高、异质性、阈值效应、半自助复制与协同效应26、阈值效应：mtDNA突变导致氧化磷酸化水平降低，当突变的mtDNA达到一定比例时，使得线粒体总的能量供应降低到维持组织正常功能所需能量的最低值时，才可能引起某组织或器官的功能异常而出现临床症状。27、DNA分子多态性的主要方式： 微卫星DNA多态性 （同一位点不同个体之间有不同长度的微卫星DNA）、单个核甘酸的变异一单核甘酸多态性（SNR）等28、STR结构：微卫星DNA又称短串联重复STR指以16

9、个碱基为核心单位串联重复而成的一类序列。微卫星DNA结构序列由中间的核心区（重复序列）和外围的侧翼区（非重复序列）组成，其核心序列为16bp,为高度重复序列。成因：1.姊妹染色单体的不均等交换2.复制滑移29、SNP:SNP是基因组中散在的单个核甘酸的变异形成的一种DNA分子多态性位置：编码区SNPcSNP、基因周边区SNPpSNP）基因间SNPiSNP）SNP非编、码区：SNP编码区=5:1成因：单个核甘酸（碱基）置换：转换：嘴咤一喀咤，喋吟一喋吟；颠换：喀咤一喋吟，喋吟一嘴咤转换：颠换=3:1。蛋白质组1、蛋白质组：生物体的全套蛋白质；或一个生命单位的全套蛋白质二倍体；3、真核细胞基因转录

10、产物为单顺反子。上5、基因是不连续的（断裂基因）22、单顺反子：一个结构基因经过转录生成一个23、重复序列：指多拷贝的相同或近似序列的4、存在重复序列，重复次数可达百万次以mRNA分子，再翻译生成一种蛋白质；DNA片段高度重复序列：按其结构特点分为2、蛋白质组特性：与基因组相比，蛋白质组有高度动态性：有组织特异性、生长发育特异性、生理病理状态特异性。3、研究的必要性：1、蛋白质的数量比基因的数量多（转录、翻译、翻译后水平的调控）2、基因组是静态的，蛋白质组是动态的3、蛋白质之间及其与其它各种大、小分子之间的广泛作用形成的犹如网络状的复杂系统。4、蛋白质组学是研究生物体全套蛋白质的组成、结构与功

11、能的科学5、蛋白质的分离：双向凝胶电泳及图像分析技术1、双向凝胶电泳2-DE:第一向的固相pH梯度等电聚焦电泳IPG-IEF第二向SDS-PAG即成的分离系统： 电泳速度只与蛋白质分子质量有关。 原理：等电聚焦电泳：基于蛋白质等电点（pl）的差异进行分离；聚丙烯酰胺凝胶电泳:是根据蛋白质分子量（Mw）的不同进行分离6、质谱技术MS:（用于蛋白质的鉴定）是在高真空系统中样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比差异，以确定样品相对分子质量及分子结构的技术。7、质谱：化合物分子受到电子流冲击后，形成的带正电荷分子离子及碎片离子，按照其质荷比大小依次排列而被记录下来的图谱，称为质谱。8、质谱仪的组成：离

12、子源、质量分析器、检测器核酸分子杂交1、核酸变性：在理化因素作用下，维系DNA二级结构的氢键和碱基堆积力遭到破坏，DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致DNA的理化性质及生物学性质发生改变2、核酸复性：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。3、分子杂交：不同来源的核酸变性后，合并在一起，只要这些核酸分子含有可以形成碱基互补配对的序列，复性也会发生在不同来源的核酸链之间，形成杂化双链4、分子杂交技术：用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核甘酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸

13、序列的位置或大小显示出来的技术。待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的DNA、RNA=5、核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的、带有标记的、并已知碱基序列的核酸片段。6、 原位杂交： 以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法7、寡核甘酸探针的特点及设计原则？特点：（1）根据需要来合成相应的核酸序列，避免了天然探针的缺点；（2）大多数寡核甘酸探针长度较短，一般为1050bp,其序列复杂度低，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短；（3）寡核甘酸探针尤其适合点突变的检测（短

14、探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值）；（4）探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱。设计原则：（1）探针长度：一般要求在1050bp;（2）G/C含量为40%60%;（3）探针分子中应避免互补序列；（4）避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个;（5）探针与非靶基因序列的同源性不能超过70%或8个以上连续的碱基同源。8、一个理想的探针标记物应具备的特性？1、灵敏度高2、标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值3、标记物对检测方法无干扰4、检测方法要灵敏、特异、稳定、简便5、标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉。9、Southern印迹杂交的基本步骤

15、？其毛细管转膜的原理？Southern印迹指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。基本步骤：1、基因组DNA经限制酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳2、将含有DNA片段的凝胶放入变性溶液使DNA变性3、将固体支持物放在凝胶上，通过毛细管虹吸或电转移将脚上的DNA片段转移到固体支持物上，转移过程中，各DNA片段间的相对位置保持不变，然后通过加热使DNA固定于膜上4、加入探针使之与膜上的DNA杂交5、冲洗掉为杂交的探针，检测杂交信号10、毛细管虹吸印迹法其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动

16、，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上11、原位杂交时组织和细胞应固定处理，理想固定液应具备哪些条件？1、保持组织细胞的形态2、对核酸无抽提，修饰与降解作用3、不改变核酸在组织细胞内的定位4、不阻碍核酸与探针的杂交过程5、对杂交信号无遮蔽作用6、理化性质稳定12、如何增强组织的通透性和核酸探针的穿透性？组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体，影响探针的穿透和杂交体的形成；去垢剂和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白质；控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落分子克隆(也称基因克隆或DNA克隆)：指按照人的意愿，在体外将制备的DNA片段与载体DNA

17、重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝的技术。又称重组DNA技术1、制备目的基因主要有哪几种方法？直接分离、人工合成、构建基因组文库G-文库、构建cDNA文库C-文库2、载体：是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来，并运送到宿主细胞进行扩增或表达的运载工具。载体化学本质为DNA分子。克隆载体：能将外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体称为克隆载体表达载体：能够携带目的DNA片段进入宿主细胞扩增和表达，获得目的DNA蛋白质产物的一类DNA分子3、转化(transformation)以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入受体细胞的过程

18、称为转化。转染(transfaction)是指以噬菌体DNA或以它为载体构建的重组子导入受体细胞的过程称为转染。感染(infection)具有感染力的噬菌体将头部重组子导入受体细胞的过程称为感染.4、重组子：含有重组DNA分子的转化细胞重组体：不同来源的DNA通过重组作用所组成的DNA分子重组DNA:不同来源的DNA通过磷酸二酯键连接而重新组合成新的DNA分子的过程5、G-文库;将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落6、C-文库:将某种生物体基因组转录的全部mRNA,经反转录产生cDN

19、A片段,再分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中7、基因组文库：含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群8感受态细胞：(competentcell)细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞。9、2型限制酶：能够识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。命名：限制性核酸内切酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶的宿主菌属名第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名第四个字母代表宿主菌的株或型若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。识别序列特点：具有回文结构的DNA片段切割方式：在对称轴处同时切割DNA的

20、两条链、在对称轴两侧相类似的位置切割两条链末端类型：平末端和3*或5*突出的粘性末端10、DNA连接酶：是一种封闭DNA链上切口的酶催化反应的化学本质：修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键反应条件：DNA连接酶的反应条件Tris-HCl50-100mmol/LpH7.5MgCl210mmol/LATP0.5-1mmol/LDTT5mmol/LVolume10-20LTemperature4-15CTime4-16h作用：能够催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子形成磷酸二酯键，实现DNA重组。连接多个平头双链DNA分子11、DNA聚合酶：酶类：1、大肠杆菌DNA聚合酶I2、T4DNA聚合酶3

21、、逆转录酶、4、TaqDNA聚合酶5、末端脱氧核甘酸转移酶6、大肠埃希菌DNA聚合酶IKlenow大片段、7、T7DNA聚合酶：活性：1、大肠杆菌DNA聚合酶I:参与DNA修复，具5f3核酸聚合酶活性、3f5和5f3外切酶活性2、T4DNA聚合酶：有3f5的核酸外切酶活性、5-3的DNA聚合酶活性。3、逆转录酶：以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链从5*末端或3*末端降解DNA杂合链中的DNA以DNA为模板， 催化合成cDNA双链。4、TaqDNA聚合酶：有强的53DNA聚合酶活性、有53核酸外切酶活性、无35核酸外切酶活性5、末端脱氧核甘酸转移酶：标记DNA的3/一OH末端；也可催化载体

22、分子或待克隆的DNA片段上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。活性同37、6、5*-3*聚合酶活性、3*-5*外切酶活性2612、工具酶作用限制酶：识别和切割双链DNA连接酶连接两个DNA分子聚合酶DNA聚合、外切酶1聚合外切TaqDNA聚合酶聚合外切逆转录酶cDNA合成末端脱氧核甘酸转移酶3*末端聚合碱性磷酸酶切除末端磷酸基T4多核甘酸激酶5*末端磷酸化核酸酶S1水解单链核酸13、载体筛选原理：通过某些特定方法，从被转化的细胞群体或基因文库中，鉴别出真正的重组子的过程14载体特点：1、独立复制2、筛选标志3、较多拷贝数4、多克隆位点5、较高遗传稳定性14、 几种常用载体比较克隆容量受体细胞筛选

23、原理质粒载体 2Kb大肠杆菌pUC系列蓝白斑筛选pBR322双抗生素筛选噬菌体载体大肠杆菌入噬菌体22Kb蓝白斑筛选M13噬菌体1Kb蓝白斑筛选木粒载体40-50Kb大肠杆菌酵母人工染色体200-1000Kb酵母细胞病毒载体动物细胞15、pBR322质粒特点：1、相对分子质量好，4.363kb2、有一个复制起始点，为松弛复制子3、可用氯霉素扩增其质粒拷贝数4、有四环素、氨芳霉素两个基因5、有24种限制酶的单一识别点16、pUC:pUC18/19质粒载体是由pBR322质粒和M13噬菌体重组构建而成的双链DNA克隆载体。pUC是系列质粒载体17、pUC质粒结构特点：1）pUC载体较小，全长仅26

24、86bp；具有更高的拷贝数2）只保留了一个药物抗性基因Ampr3）大肠杆菌3半乳糖甘酶基因的启动子及其编码“-肽链的DNA序列LacZ基因；4）有一个多克隆位点区，极有利于克隆外源基因。16、分子克隆的基本步骤分：目的基因的获得（基因文库、逆转录、人工合成、从基因组分离）、载体的获得切：限制酶切割目的基因和载体，产生平末端或相同的粘性末端；接：连接酶连接分子间的粘性末端或平末端；转：重组体导入受体细胞，转化或转染；筛：双抗生18、重组体的筛选方法：1、根据遗传表型筛选（抗生素抗性筛选、B4乳糖甘酶系统筛选）2、根据重组子结构特征筛选（1、快速裂解菌落并鉴定分子大小2、内切酶酶切图谱鉴定3、核酸

25、分子杂交筛选4、PCR筛选重组子5、核甘酸序列测定）19、简述如何筛选pUC载体和目的基因形成的重组体：（1）2.69kb,保留了pBR322质粒的Ampr,转化菌可在氨芳青霉素培养基中存活；（2）LacZ基因编码3-半乳糖甘酶的一个片段，与宿主细胞编码的缺陷型3-半乳糖甘酶互补成为完整的酶，催化指示剂底物X-gal形成蓝色产物，菌落呈蓝色；（3）LacZ基因中有MCS外源基因插入，使LacZ基因插入失活，不能表达a-片段，不能与宿主细胞互补，X-gal不能转变为蓝色，表现白色菌落。19、连接DNA片段的方法主要有哪些？粘端连接、平端连接、定向连接、同聚物加尾连接、人工接头连接20、重组体DN

26、A导入受体细胞的方法主要有哪些？1、CaCl2转化法2、电穿孔法3、磷酸钙共沉淀法4、入噬菌体的转染5、脂质体法6、显微注射法核酸分离与纯化：1、鉴定完整性：以澳化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果可用于判断核酸完整性1、完整无降解或降解很少的总RNA电泳图，除具特征性三条带外，三条带的荧光强度应为一特定比值2、降解系数大的核酸条带相对分子质量大，电泳迁移率低，澳化乙锭嵌入核酸中的数量也增多，荧光强度高；反之3、一般28S或23SRNA的荧光强度约为18S或16S的2倍，否则提示有RNA降解，若在加样槽附近有条带，则DNA有污染2、真核生物RNA18s28S原核：23s16S3、mRNA代表基因

27、转录水平，行使模版功能4、核酸纯度鉴定：1、紫外分光光度法：最常用A：核酸在260nm处有最大吸收峰B：蛋白质在280nm处C：盐和小分子在230nmD:酚在270nm处5、纯DNAA260/A280=1.8A260/A280=2.0高质量RNA(1.8-2.1)A230/A260=0.4-0.5若升高，有残余盐2、荧光光度法PCR1、PCR聚合酶链反应技术的原理：由人为提供模板DNA、DNA引物、4种dNTP和DNA聚合酶，在体外条件下实现DNA复制的过程。2、PCR用途：目的基因克隆、基因体外突变、DNA和RNA的微量分析、DNA序列测定、基因突变分析3、PCR三个基本步骤：变性退火延伸变

28、性：93-98摄氏度退火：37-65摄延伸：70-75摄,，整个PCR过程一般需进行三十轮的循环，4、退火温度由引物的Tm值决定，延伸温度和时间由TaqDNA酶活性决定一般变性温度与时间为94C3050s产物由引物决定，循环次数由初始模版浓度决定5、变性：在第一轮循环前需预变性，在94c下变性5-10min非常重要，它可使模板DNA完全解链；退火：引物退火的温度的高低和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5c退火温度越高，所得产物的特异性越高延伸：反应通常为72C,接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75C

29、6、Tm值：DNA热变性发生在一个很窄的温度范围内，将DNA变性达到50%时的温度称解链温度或溶解温度。GC越高，Tm值越高7、 标准的PCR反应体系模板DNA0.12ug引物各0.11.0umol/L4种dNTP混合物各200umol/LTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5-2.0mmol/L8、产物不同：1、长片段产物以算术倍数增加在终产物中忽略不计2、短：长度严格定格在两引物5*端之间，是需要扩增的特异片段以指数倍数增加以上是PCR产物不需纯化的原因9、产物不同原因：引物结合的模版不同10、引物：实际上就是两段与待扩增靶DNA序列3侧互补的寡核甘酸片段。扩增时从引物的3端开始，以5-

30、3方向延伸，两引物的5端决定扩增产物的两个5末端位置，两引物间距离决定扩增片段的长度。11、引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的12、引物设计有3条基本原则：1、引物与模板的序列要紧密互补；2、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构3、引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)13、PCR扩增产物的检测方法：1.凝胶电泳主要有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳琼最常用最经典可判断产物大小2、限制性内切酶酶切分析RFLP若知道PCR扩增片段的序列或限制性内切酶酶切图谱，则可选择合适的限制性内切酶消化PCR产物，再进行电泳分析，根据PCR酶切产物的电泳图谱，可

31、判定PCR产物的特异性及是否存在突变。用于检测基因突变3、分子杂交为了确定PCR产物是否是预先设计的目的片段或产物是否有突变点杂交、Southern印迹杂交点杂交灵敏度较高，特别适用于特异性不高的PCR扩增产物分析。用于检测基因突变，常规的southern印迹杂交可鉴定PCR产物的大小和特异性4、酶检测PCR法首先对PCR反应的引物5端进行修饰，一个引物的5端携带便于PCR产物固定的功能基因，如生物素等，另一个引物的5端具有便于酶联显色检测的基团，如酶或抗原、抗体等。通过包被于微孔板中的基团如亲和素，将PCR产物固定于微孔板上，进行酶联显色，比色测定适用于检测引物5端修饰的PCR产物比电泳检测

32、灵敏度高，比分子杂交法简便。5、测序PCR产物直接进行测序分析可检测基因突变是检测其特异性的最可靠方法14、RFLP限制性内切酶酶切分析：由于基因突变导致某一限制性内切酶的酶切位点序列产生或消失，经电泳分离出大小不同的片段。15、提高PCR的特异性和敏感性1.热启动PCR一种在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪,通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。2、梯度PCR复性温度高低决定扩增的特异性产物高低选定一个复性温度范围，跨越引物Tm值1020C。早期循环，复性时从高温开始，逐渐降低复性温度，直至最低复性温度3、巢式PCR(nestedPCR)嵌套式PCR用2

33、对引物进行2次PCR来扩增目的基因第一次PCR一对外侧引物第二次PCR一对内侧引物4、免疫PCR酶本测PCR法通过免疫酶反应+PCR来进一步提高敏感性和特异性16、多重PCR它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同17、不对称PCR:目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般是0.01：0.5M,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板、制备杂交探针、基因组DNA结构功能的研究18、反向PCR目的：在于扩增一段已知序列旁侧未

34、知DNA序列19、任意引物PCRAP-PCR区分不同种的菌株、种内不同血清型、血清型内不同亚型。作用：判断相同种的不同分离株是否有流行病学上的相关性20、重组PCR:利用PCR技术，使两个不相邻的DNA片段重组在一起的方法，称重组PCR目的：使2个不同来源的DNA片段重组；构建基因突变体如点突变、缺失、插入等。21、反转录PCR(RT-PCR)RNA分子为模板进行的扩增，以其首先要进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应关键步骤是RNA反转录为cDNA,cDNA进彳TPCR与一般由PCR无差别。22、荧光定量PCR(FQ-PCR又称实时PCR(RT-PCR探针类PCR通过对荧光信号的检

35、测实现对PCR过程中产物量的实时监测，并精确地计算出PCR的初始模板量23、荧光定量PCR技术在HBV检测中的应用：HBV感染的早期诊断、监测治疗效果、判断病情，指导制定合理的治疗方案、在乙肝病毒耐药性检测中的应用、血液制品和鲜血员的筛选，隐匿性肝炎的发现、HBV-DNA定量有助于指导怀孕，降低宫内感染的发生率、筛选肝炎的质量药物24、水解探针：Taqman探针：PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核甘酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR仪检测不到荧光信号，PCR扩增时(在延伸阶

36、段)Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团，和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号25、Beacon技术:即分子灯塔法或分子信标技术：单链寡核甘酸荧光探针，在无靶序列的情况下，探针始终是发卡结构，报告基团的荧光被猝灭基团猝灭，使荧光检测仪检测不到荧光信号；而在有靶序列时，即在PCR的退火阶段探针与靶序列结合，使荧光报告基团和猝灭基团分开，这样荧光仪可以检测到荧光，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。26、FRET技术：基本原理是：两条直线型寡核甘酸探针，其中一条的3端标记荧光激发基团，另一条的5端标记荧光检测基团，在无靶序列的情况下，两条探针分开，无法进行能量的传递

37、，这样荧光仪不能检测到荧光信号，当有靶序列时，即在PCR的退火阶段两条探针与靶序列结合，使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递，这样荧光仪就可以检测到荧光信号，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。所以对该信号的检测是在退火后进行27、Sanger定义：以靶DNA链为模板，指导核酸合成的过程中，以释放荧光为检测信号，从而对靶DNA链进行实时测序的方法原理：利用DNA聚合酶，以单链DNA为模板，以dNTP为底物，在四组相对独立的反应体系中分别加入不同的ddNTP作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成四组有序梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射

38、自显影检测后直接识度待测DNA的序列28、 如何来确定模板DNA的量？当固定C循环数后， 荧光信号与模板数成正比； 当固定t荧光信号值后，模板数就与循环数成反比。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始模板拷贝数的对数，纵坐标代Ct值只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。29、Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析30、荧光域值：是指PCR反应的前15个循环的荧光信号31、RNA的体外扩增NAS

39、BA核酸序列的扩增NASBA、转录依赖的扩增系统TAS自主维持序列扩增或再生式序列复制3SR32、基本原理：以RNA为模板在体外大量扩增RNA,利用3种酶：逆转录酶、T7RNA聚合酶和RNaseH,模拟逆转录病毒RNAgenome的复制过程，来大量扩增RNA。反应体系温度均一at42C、RNA产物以10的指数方式增加33、2个特殊引物：引物A一与RNA3端互补，5端含T7启动子引物B与cDNA第一条链3端互补34、连接酶链反应LCR基本原理：是以DNA连接酶将某一DNA链的5磷酸与另一相邻链的3羟基连接为基础的循环反应。1、遗传性疾病的分子诊断策略和方法？遗传性疾病分两类：符合孟德尔遗传规律的

40、单基因遗传病、不符合孟德尔遗传规律的多基因遗传病（又称多因素性疾病）2、三代遗传标志1.RFLP2.STRVNTR3.SNP2、遗传病的分子诊断：1、血红蛋白病：血红蛋白病可以分为由于珠蛋白一级结构的变化所导致的异常血红蛋白病；由于珠蛋白多肽链的合成速率不平衡所导致的地中海贫血2、镰状细胞贫血：一种遗传性贫血症，属隐性遗传性疾病。患者的红细胞缺氧时变成镰刀形，失去输氧的功能，破裂造成严重贫血。该病常见于非洲和美洲黑人，因为杂合基因型细胞贫血症状轻微，但红血球内的轻微缺氧对寄生在红血球里的疟原虫却是致死的，有利于防止疟疾的流行限制性内切酶Mstn识别序列为CCTNAGGN为任意核甘酸。因此3珠蛋

41、白基因的第5、6、7密码子中有该内切酶的识别位点。发生镰状突变后该酶切位点消失3、地中海贫血：是由于珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病A:PCR法、Southern印迹法、B:PCR-RDB法、PCR-ASO法、等位基因特异性PCR（ASPCR、芯片技术3、产前遗传缺陷的分子诊断：产前诊断PND、植入前遗彳学诊断PGD:PND和PGD的适应症：PND:（通过对绒毛组织或羊水细胞的基因分析，可诊断100多种单基因遗传病。PGD:采用极体分析法对30多种遗传病进行诊断。）A.有可能孕育出严重遗传性疾病和先天性畸形胎儿的孕妇。B.夫妇一方有某种遗传病或曾生出过某种遗传病患

42、儿，或孕妇有X伴性隐性遗传病家族史。C.夫妇任何一方为染色体异常、染色体平衡移位和倒位携带者。D.早孕阶段曾服用过致畸药物或曾有病毒感染史等致畸情况。E.羊水过多或过少。F.原因不明的多次流产、死胎、死产的孕妇。G.胎儿发育迟缓。H.未触到正常的胎儿。I.年龄超过35岁的孕妇等等4、 肿瘤细胞增生的分子机制： 原癌基因活化或抑癌基因失活； 促凋亡基因失活或抑制凋亡基因功能增强；DNA修复基因失活5、家族性高脂血症的分子诊断表型分类基因缺陷临床特征家族性高胆固醇血症LDL受体缺陷胆固醇升高为主，多为冠心病和高脂血症家族史。家族性载脂蛋白B100缺陷ApoB100缺陷同上家族性混合型高脂血症不清楚胆固醇和甘油三酯均升高，VLDL和LDL皆增加，有冠心病家族史。 家族性异常3脂蛋白血ApoE异常胆固醇和甘