高效液相色谱法测定羟基卡马西平血药浓度

1、高效液相色谱法测定羟基卡马西平血药浓度        【摘要】     目的：建立测定血清羟基卡马西平浓度的高效液相色谱法。方法：以C18反相柱（Hypersil C18，4.6 mm×200 mm，10 m）为色谱柱，流动相为甲醇水（4060），流速为0.8 mL/min，检测波长230 nm，以乙醚为提取剂。结果：羟基卡马西平低、中、高（0.74、5.90、23.60 mg/L）3种浓度的平均回收率分别为100.2%、94.9%和90.1%，日内及日间

2、RSD均小于5%（n=5）；线性范围为0.4759.00 mg/L，回归方程C=0.03293A+0.01032，r=0.9998。结论：该方法灵敏、准确、简单、快速，取血量少，适用于羟基卡马西平血药浓度的监测和药动学研究。     【关键词】  羟基卡马西平；高效液相色谱法；血药浓度    Determination of monohydroxycarbazepine in serum by HPLC    PANG Dezhi, SONG Xinwen, WANG Yan

3、g, ZHANG Huanian, XU Hua (The Childrens Hospital of Wuhan, Hubei Wuhan  430016, China)    Abstract Objective:To set up an HPLC method for the determination of the monohydroxycarbazepine (MHD) in blood serum.Methods:The MHD was analyzed in a reverse phase HPLC system (C18 column,

4、200 mm×4.6 mm, 10 m); the mobile phase was methanolwater (4060) with a flow rate of 0.8 mL·min-1 and UV detection wavelength of 230 nm. Serum samples containing the drug were extracted with ether.Results:The average recovery rate of the MHD in low, medium and high concentrations (0.74,5.90

5、,23.60 mg·L-1) were 100.2%, 94.9% and 90.1% respectively. The interday and intraday relative standard deviations were less than 5% (n=5). The calibration curve had a good linearity while the concentration of MHD was within the range of 0.4759.00 mg·L-1.The regression equation was C=0.03293

6、A+0.01032,r=0.9998.Conclusions:The method is sensitive, accurate, handy and speedy, and may be used in the monitoring of the serum concentration of MHD and pharmacokinetic studies of the drug.    Key words  Monohydroxcarbazepine;  HPLC; Serum concentration  羟基卡马西平（monoh

7、ydroxycarbazepine，MHD）是奥卡西平的活性代谢产物，奥卡西平口服后可迅速吸收，并通过首过效应几乎全部转化为MHD。虽然奥卡西平本身也有抗癫痫效应，但实际上真正在体内发挥作用的主要还是其活性代谢产物羟基卡马西平，故临床上往往通过测定MHD的血药浓度来判断奥卡西平的疗效和不良反应。目前国内关于羟基卡马西平血药浓度测定的方法主要是高效液相色谱法14，但这些方法都是采用内标法进行测定，操作较繁琐，且所需血样量较多，要在儿科临床普遍应用尚有不足。为此，本文建立了一种用外标法进行定量、简便快速、所需血样量较少的反相高效液相色谱（RPHPLC）测定小儿血清羟基卡马西平浓度的方法。 

8、;   1  仪器与试药    1.1  仪器    Agilent 1100高效液相色谱仪，包括G1311A四元泵，G13222脱气机，G1313A柱温箱，G1314AUV紫外检测器，HP化学工作站（美国HP公司）；WH1微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；LDZ40.8A台式离心机（北京医用离心机厂）；AB204万分之一电子分析天平（瑞士产）。    1.2  试剂与药品    羟基卡马西平对照品（华中科技大学同济药学院

9、提供，批号051020，纯度>99），奥卡西平对照品（华中科技大学同济药学院提供，批号051028，纯度99.8），卡马西平对照品（中国药品生物制品检定所，批号01429503），苯巴比妥对照品（中国药品生物制品检定所，批号12229602），硝基安定对照品（中国药品生物制品检定所，批号12179701），氯硝西泮对照品（中国药品生物制品检定所，批号171227200302），乙醚（分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂，批号070321），甲醇为色谱纯，水为超纯水。    2  方法与结果    2.1  色谱

10、条件    色谱柱为Hypersil C18柱（4.6 mm×200 mm，10 m）；流动相为甲醇水（4060），流速0.8 mL/min；柱温30 ；检测波长为230 nm；进样量20 L。    2.2  贮备溶液的配制    精密称取羟基卡马西平对照品11.8 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解后定容至刻度即成羟基卡马西平贮备液（118 mg/L），置4 冰箱保存。临用时将贮备液用甲醇稀释至所需浓度即得羟基卡马西平工作液。    2.

11、3  样品处理    精密吸取样品血清100 L置5 mL离心试管中，加入4 mL乙醚进行旋涡振荡萃取2 min，2 000 r/min离心3 min，吸取乙醚层，如此操作3次，合并3次乙醚，置40 水浴蒸干，残渣加流动相100 L溶解。    2.4  标准曲线    用羟基卡马西平贮备液按照逐级倍比稀释的原则用甲醇制成浓度分别为0.47、0.93、1.85、3.70、7.40、14.80、29.50、59.00 mg/L的系列工作液，精密吸取各工作液1 mL置5 mL离心试管中，于

12、50 水浴中用氮气吹干，然后分别精密加入1 mL空白人血清，漩涡混合10 min，即得与系列工作液浓度相同的含药标准血清。取含药标准血清100 L，照“2.3样品处理”项下的方法进行操作，取20 L进样测定，记录色谱图，以样品浓度为C，峰面积为A，得回归方程：C=0.03293A+0.01032，r=0.9998，标准曲线的线性范围为：0.4759.00 mg/L。当信噪比S/N=3时，MHD的最低检测限为0.2 mg/L。MHD的保留时间约为11 min，见图1。    图1  羟基卡马西平色谱图    2.5 

13、 空白与干扰试验    精密吸取空白血清100 L，照“2.3样品处理”项下的方法进行操作，取20 L进样测定，记录色谱图，结果在11 min左右未见色谱峰，表明血清中的杂质不影响MHD的测定。    另分别取奥卡西平、卡马西平、苯巴比妥、硝西泮及氯硝西泮的对照液加入空白血清中，漩涡混匀后，照“2.3 样品处理”项下的方法进行操作，取20 L进样测定。结果奥卡西平的出峰时间为14.3 min，卡马西平的出峰时间为26.5 min，苯巴比妥的出峰时间为9.7 min，硝西泮的出峰时间为29.9 min，氯硝西泮的出峰时间为29.2 mi

14、n，表明这5种常用的抗癫痫药物亦不干扰MHD的测定。见图2。    2.6  回收率和精密度试验    准确配制MHD浓度为0.74、5.90、23.60 mg/L的血清样品各5份，按“2.3样品处理”项下操作，用标准曲线计算样品浓度，与配制浓度比较，得低、中、高3种浓度的方法回收率及日内RSD；每天取上述配制样品各5份连续测定3日，得日间RSD，结果见表1。表1  羟基卡马西平（MHD）血清回收率及精密度    3  讨论    羟基卡马西平结

15、构中有两个苯环，有明显的紫外吸收，在200400 nm的波长范围内进行紫外扫描，其在210 nm波长处吸收度最大，在254 nm及270 nm处亦分别有吸收峰。但采用210 nm作为检测波长1，4，由于其与甲醇的最大截止波长205 nm比较接近，实验中发现流动相对测定的干扰较大且容易造成基线的严重波动，故不采用。254 nm和270 nm虽然也可作为检测波长，但其吸收太小，需取血清0.5 mL进行测定，这样造成患儿静脉采血量较大。用230 nm作为检测波长，其吸收度完全可满足实际检测的需要，同时所需血清仅为0.1 mL，特别适合于测定儿童羟基卡马西平的血药浓度。  

16、0; 羟基卡马西平为非极性分子，脂溶性较高，可用乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚等进行提取，考虑到三氯甲烷有一定的毒性，乙酸乙酯的沸点稍高，故选用毒性较小、沸点很低、容易挥发的乙醚作为提取剂。实验发现，用乙醚提取血清中的羟基卡马西平，提取2次只能使回收率达70%80%左右，提取3次则可使回收率达90%以上。    苯巴比妥、卡马西平、硝西泮以及氯硝西泮是目前儿科临床上常用的一线抗癫痫药物。本研究表明这几种药物与奥卡西平合用时均不影响其活性代谢产物羟基卡马西平的测定，因此本文所建立的方法适合儿科临床用于MHD的血清药物浓度测定和药动学研究。    【参考文献】  1 付 琳, 邱相君, 代宗顺, 等. 奥卡西平片的人体相对生物利用度研究J. 中国药科大学学报, 2004, 35(3): 244247.    2 胡国新, 邱相君, 周红宇. 反相高效液相色谱法测定奥卡西平活性代谢物及其在健康人