GFP成像研究植物细胞区室化的方法与应用

1、GFP成像：研究植物细胞区室化的方法与应用摘要水母gfp（绿色荧光蛋白）基因的克隆，以及它在转基因植物细胞内亚细胞定位表达的改进，已经给细胞内组织学和动力学分析带来新的观念。 GFP与已知或非已知的完整蛋白的融合体显示出这些蛋白的定位，以及它们是否从一个区室转移到另一个中去。 研究者审慎地将GFP与其具有不同光谱性质的变异体定于不同的区室中，分析它们在发育过程中或是响应环境变化时大小、形状、流动性及动态的变化。 GFP变异体间的荧光共振能量转移(FRET)能够辨别蛋白与蛋白之间是否结合。 GFP还被用作传感蛋白，去检测钙离子、pH、电压、金属离子及酶活性的变化或区分。GFP的光漂白、光激活，与

2、荧光相关光谱学的结合能测量GFP在区室内或区室间的扩散和运动的快慢。 这份评论涵盖了过去这些方法的应用，以及GFP成像在理解植物细胞的功能结构上的潜力发展。关键词绿色荧光蛋白 显微（镜检）术 细胞器 定位 光漂白 质体小管 共聚焦显微术介绍绿色荧光蛋白基因在细胞内表达的技术诞生，使十年前不敢想象的很多实验变成了现实。 在很多应用中，人们可以有了新的探究途径去了解细胞活动的组织结构。 这份评论将着重于GFP表达和成像方法，它们在理解植物细胞内的区室化上已经并将继续提供前沿动力，而那些关于如何使用特别的荧光，共聚焦激光扫描及多光子显微术去观察GFP衍生的荧光蛋白，则不在此累赘了。 不过可以在后面一

3、些引用文献中找到，我将简要地介绍一下现有GFP成像新应用的研究，而阐明可行的实验。 目前而言，GFP成像在动物和真菌细胞中的成功运用要多于植物细胞，部分是因为早期存在于如何在植物中使用水母GFP的问题。 这个初始的动物基因含有在植物中会被错误识别为内含子的序列，导致了很低的表达水平。 当出现修饰型的、热稳定的、高亮度荧光的GFP之后，其产量与分布已经带动了许多植物系统的实验。通过对表达与哺乳动物及其它生物体的GFP进行重新编码，可以得到适用于维管植物的新基因。 但是密码子的改变经常会破坏隐秘剪接位点，因而只是有些，而并非全部带有改变了的光谱特性的新GFP变种可以不经进一步修正就可以在植物中发挥

4、功能。 许多不同的GFP变异体在一系列评论和文章中讨论过，就不在这里重复了。无论怎样，在实验设计中，如何选择一个带有正确特性的植物表达GFP变异体，很明显是一个关键的抉择。 GFP作为一个荧光探针，最主要的一个优点是不需要外源的共激活因子。 GFP可以在整个组织中表达，并且在整个检测过程中都不受引入外界试剂的干扰。 由于许多对动物细胞所采纳的染色和染料不能渗透入植物细胞，GFP技术可能最终成为植物细胞生物学而非动物的重要推动力。研究蛋白在细胞内的定位为了理解植物细胞是如何有功能地组织起来，就有必要知道在发育过程中，和受到特定环境条件的影响下，特定时间下，特定植物细胞内，酶和调节蛋白在何处定位。

5、一个特定酶的定位对于理解细胞内新陈代谢的区室化是个关键的信号。 区室阻止特定蛋白、离子和复合物的进入，以杜绝不需要的反应，同时汇集酶反应过程中的参与物以易化细胞内的生理活动。 一系列已知的例子验证了，在一个特定反应中酶与底物共处一个区室，而其产物又在另一个区室中被使用。 这就提出了问题，产物与底物是如何从一个区室运输到另一个来完成一个代谢途径。 植物细胞也包含有许多亚细胞定位还未知的酶，进一步地说，通过基因组“蛮干”的测序，而得到的参与酶反应的未知酶，如果不能知道它的细胞内区室定位，则可能不能被很好地理解。 通过目前计算机的方法从DNA序列中预测细胞内定位，虽然又用，但不是结论性的。另外，一些

6、植物蛋白也已经被发现定位于超过一处的地方。 细胞器的分离及蛋白的纯化，在阐明细胞内定位上常存在技术上的难关。而在组织切片中去免疫检测一个蛋白，其抗体的制备又费时费力。因而，将GFP的编码序列融合到未知定位基因地编码序列，对于决定在植物细胞内一个蛋白，同时也是一个生化的、调节过程的位置，已经成为一种及其有用的方法。 GFP编码序列可以融合道目的基因的编码序列的5端或3端，翻译形成N端或C端的融合GFP。 这种融合基因已经被掺入到稳定遗传转基因植物，或是导入植物细胞用于瞬间表达。稳定遗传的转基因植物的获得，可以检测多种不同的表达GFP融合蛋白的细胞种类。这种优势的体现，在于技术上并非所有的细胞种类

7、都适用于瞬间表达。 另外，由于DNA掺入常常引起损伤，基因引入数量以及GFP在瞬间表达中转录都有不确定性，因此，有时候分析健康的稳定转化体比起由于DNA掺入而受到影响的细胞来说，要更有说服力。 当然，瞬间表达由于快速简单，是一种非常有用的工具，尤其是在投入时间去获得转化体之前。 洋葱表皮，有着极其例外的清晰细胞质，及单层活细胞，是瞬间实验中非常有用的材料。 通过各种构建体的粒子轰击，细胞壁、叶绿体、细胞质、核以及内质网都可以被不同瞬间表达GFP融合体标记。 由于GFP体积小，可以进入核孔，因此没有融合其它多肽时，GFP在植物、动物和酵母细胞的细胞质和核中都有发现（图1A）。 由于融合一些植物基

8、因序列后发现仅在核内有GFP荧光，可以得出结论，融合的那些序列编码核定位蛋白。 在定位于核内的GFP-植物蛋白融合体中，有cryptochrome CRY2，一种蓝光光感受器，以及ROOT HAIRLESS 1基因，它对初生根根毛的形成及幼苗的生存有作用。 GFP和一种geminivirus运动蛋白的融合揭示了它是一种核穿梭蛋白。 融合其它未知定位的蛋白，已经揭示了它们在质体、线粒体或是细胞液的区室分布。 一种具有香叶基香叶基双磷酸合成酶活性的蛋白，及一种NADP依赖型异柠檬酸脱氢酶，被显示定位于线粒体中。 噬菌体形RNA多聚酶类似物基因的融合体显示一个是定位于线粒体，而另一个被转运到叶绿体。

9、 通过融合可能的定位信号到GFP上，三个核内编码的RNA多聚酶因子都显示定位于质体中。 拟南芥中三个不同编码丝氨酸乙酰转移酶的cDNA克隆基于GFP融合蛋白定位，被定位于三个不同的区室细胞液、叶绿体和线粒体。 GFP融合体也验证两个正式被发现于叶绿体中的蛋白：拟南芥PALE CRESS核基因产物，用于正常的叶绿体发育，和AST82，一种硫酸转运体。 GFP融合在判断未知cDNA编码蛋白亚细胞定位的成功，引发了一种命名为“基序罗网”方法的发展。先将随意的DNA片段融合到gfp，然后分离各种在不同亚细胞区室表达GFP的细胞，最后用RT-PCR克隆出表达的DNA片段。 GFP融合体还可以被用于发现植

10、物细胞在环境刺激下或是发育途径中，一个蛋白是不是从一个定位转移到另一个定位。 phyA和phyB是光感受器的光敏色素家族成员。 GFP被融合到其编码序列上，通过激发红光，phyA和phyB被转移至核内；红外线处理，能抑制红光造成的光形态应答，发现phyB而非phyA，由红光引发的运动被抑制了。 类似的，通过与GFP融合，欧芹bZIP转录因子CPRF2的运动也显示受到光敏色素的调控。 GFP还被用于研究植物中核输出途径及胞间连丝间蛋白的穿梭。 GFP融合在判断一个蛋白的细胞内定位上并不是一种完全正确无误的方法。 由于GFP与酶的融合常常不会抑制酶的活性，因而GFP普遍被认为是无害的标记。 然而，

11、一些证据表明在特定区域的高表达有损于细胞。 例如，Haseloff等发现，除非GFP被隔留在ER中，否则很难拿到高荧光转基因植物株系。 虽然绝大多数在动物细胞中表达GFP的报道说明GFP表达没有毒性，但有害性有时仍然被发现。此外，在特定情况下，GFP/蛋白的融合蛋白与野生型蛋白在亚细胞定位仍有可能有区别。 GFP的存在可能会掩盖住融合蛋白上穿梭序列编码的潜在定位信号。 尽管大多数真菌与植物的线粒体研究表明，含有定位于线粒体的穿梭序列的信号蛋白有效地转运到目的细胞器， 但错例仍有时发生。 相反，如果GFP融合造成融合蛋白的构型发生变化，原本在没有GFP时或是缺乏某些内源配基时应该被掩盖住的定位信

12、号，会被激活。 另一个问题是，融合目的基因序列与gfp可能导致不正常折叠或是编码的融合GFP不稳定，因而很难检测到荧光。在正规文献中这种阴性结果很少提起，但私底下一些研究者碰到过获取不到高亮度荧光蛋白的问题。融合蛋白N端的正确折叠被显示会影响GFP的C端的折叠水平。例如，麦芽糖结合蛋白的信号序列与GFP的融合在大肠杆菌中非正常折叠，而且缺失荧光。GFP标记区室 GFP与穿梭序列或是完整蛋白的融合体不仅可以判断特殊分子的定位，还可以用于商讨标记精细的区室。这些实验的目的可能是为了研究关于一个或多个区室的数量、大小、形状、运动性、与其它细胞器的结合，以及观察在发育过程中或是环境应答的情况下动态的变

13、化。GFP定位已经帮助人们观察到以前不可能观察到的植物细胞内的组织结构（图1、2）。 一些研究者有意地去标记核来研究区室。 Chytilova等人设计了含有一个NLS的GFP/GUS融合体的融合基因，用于获得有标记的核的转基因植物，后者可以用于研究在细胞周期中核的形态及运动。 通过融合GUS，增大了GFP蛋白的大小，造成了GFP在核的滞留。 从SV40中获得的核定位信号（NLS）融合于GFP上， 可以获得绿色荧光核的转基因植物（图1B），但这种较小的GFP融合蛋白在细胞质中仍然可以观测得到。在植物细胞中，其它的区室也已经被标记，液泡, 过氧化物酶体, 高尔基体，线粒体（图1C，2D），质体（图

14、2A，3），细胞骨架，质膜，细胞壁和ER（图1D，2C）。 用GFP融合体去标记确定某些细胞结构，如核和细胞壁，能通过和细胞的光显微图像比较而得到确定。而其它荧光显现出的细胞器或结构的确定则并不总是很明显，当然，需要实验的验证。一个常用的方法是，用一种特殊的化学染料标记一种容易标记的细胞种类，再用标记后的图像与绿色荧光的图像进行比较。 举例来说，用线粒体特殊的荧光染料可以验证线粒体的特殊标记，GFP和叶绿素自发荧光的红色信号的共定位可以确定叶绿素的定位。 GFP标记的另一种细胞内的“区室”则是植物病毒。激发荧光的病毒穿越胞间连丝，从一个细胞转移到另一个细胞，这种观察对理解病毒的增殖与传播提供了

15、新的途径。进一步而言，GFP可以用于标记病毒蛋白，如运动蛋白，观察病毒编码的蛋白如何与细胞内的组织结合。这一方面的更多内容可以在近期的文章中找到。 然而，绝大多数亚细胞区室的标记必须通过引入融合gfp基因至核内，并须经蛋白转移至所需的场所。由于一些物种的质体染色体可以转化，出现了一种可行的选择方法。 GFP编码区通过分子轰击引入烟草或马铃薯的叶绿体，或通过原生质体DNA吸收，而得到含有高亮度荧光质体的转基因植物（图3）。 Khan和Maliga将GFP编码区融合一种抗生素抗性选择标记到一种叶绿体DNA转化载体，报道说得到有荧光质体的转基因植物。GFP也可以通过分子轰击或是叶绿体微注射在叶绿体中

16、瞬间表达。 除了辨别正常植物细胞内区室的特征，区室的标记在分析由于突变或是病理攻击而造成的细胞功能损伤时非常有用。 例如，带有GFP标记ER的转基因植物细胞，可以用于观察ER在遭受烟草镶嵌病毒或是豇豆镶嵌病毒的感染后引起的变化。质体的GFP标记在细查叶绿素缺失的突变体植物中应该是相当有帮助，因为用光学显微镜是很难观察不正常的质体。 在植物系统中，区室标记需要进一步研究的另一应用是，标记区室以利于它们的分离。Galbraith等证明了GFP标记的核可以用流动分类的方法从细胞沉淀物中得到分离。 用GFP荧光作为一种分子标记来分离GFP标记，而用传统方法又无法轻易分离的细胞器和区室，也将是一件可能的

17、事。多个区室的荧光标记 许多生物合成及代谢过程需要不同的细胞器或是区室共同作用。 亚细胞结构的排列位置可以影响扩散效率，因而，在发育过程或是环境应答中区室间距离与联系发生了改变，可能会对功能发生很大的影响。 观察区室位置与运动的变化，可以用信号互不相同的荧光探针去标记。 一些植物区室和结构在自然状态下存在自发荧光，其波长不同于GFP的激发与发射波长，从而可以同时观察到GFP标记结构与自发荧光物体。 至今，自发荧光与GFP的结合使用已被主要地用于观察红色荧光的叶绿体与GFP标记的线粒体、核或ER。（图1） 关于用GFP变异体双标记细胞，只有一些报道，但接下来的几年，这种方法的成功应用会增加得很快

18、。蓝绿色和黄色荧光蛋白在激发波长上不同，能在一个细胞的不同区室中表达，进而观测到多个结构。 具有不同光谱特性的GFP类似物，红色和黄色荧光蛋白，已经被分离，在双标记实验中很有前景。 在动物细胞中，线粒体与核，或是线粒体与ER可以被同时地显现，染色质与核膜被同时标记，用于分析在细胞分裂时的事件。 目前，多个荧光化学探针可以成像出区别于GFP标记的区室（例如线粒体或是细胞壁）。另一种发展方向可能是结合其它荧光蛋白和GFP变异体。 光敏色素可以改变为荧光标记分子用， 它们的红色荧光可以轻易地与GFP的绿色荧光分开。这些所谓的“phytofluros”有其自身的缺陷，就是必须加入外源的共因子，这使其不

19、能像GFP那样用途广阔。 另一种多肽标签需要一种共因子，一种结合到荧光素衍生物的多肽，也可能在植物细胞中最终找到与GFP结合的应用。 显微技术与光谱学技术的进步同样会促进GFP变异体信号的分离。荧光寿命成像显微镜技术(FLIM)已经成功地分离到一些光谱类似的GFP变异体，因为它们的荧光寿命可以被区分。FLIM也可以与FRET结合使用，特别是用于检测荧光信号的供体与受体的关系。GFP用于测量区室内的参数 细胞器分离已显示区室之间在分子浓度上有所区别。一些分子探针，可以辨别体内不同区室间特定参数的梯度与动态变化。 GFP变异体可以提供新的方法，去测量和比较不同区室的容量。 修饰过的GFP已经合成用

20、作pH、膜电压、蛋白酶、金属离子或是钙离子的指示剂。 具有pH依赖型吸收与荧光发射的GFP变异体已经得到。 通过引入这种GFP， 在HeLa细胞的细胞液、核以及线粒体基质中的pH可以被测量。 GFP与一种电压敏感的K通道的融合体可以在动物细胞中测量电压的变化。为了观察蛋白酶活性，一种蓝色荧光的GFP变异体（BFP）和一种GFP变异体通过一个蛋白酶结构域链接在一个杂合蛋白中。BFP作为供体而GFP作为受体, 荧光共振能量转移(FRET)便可以发生。一旦蛋白酶酶切发生，则供体与受体GFP就被分开。 金属离子可以被金属结合GFP变异体化验，其技术是基于金属离子接近发色团而造成荧光的湮灭，或是通过具有

21、一个金属离子结合结构域的重排GFP进行的FRET。 类似地，GFP/钙调蛋白杂合蛋白(cameleons)也已经被制备用于检测细胞内的钙离子。 对于cameleon，钙离子浓度的提高导致能量在一种蓝青色荧光蛋白和一种黄色荧光蛋白之间的转移。 在这些GFP传感器中，至今只有cameleon被报道运用于植物中。它们被利用为检测拟南芥防卫细胞的钙离子的变化。其它的基于GFP的传感器今后会面世，因为研究发现，很多GFP变异体通过重排编码区，增加传感结构域，表达时仍然保留荧光。 FRET也可以被用于观察在一个区室内两个蛋白之间的结合，或是检测一个蛋白从一个区室到另一个的运动。虽然这种运用还没有在植物系统

22、中报道，但通过GFP-FRET已经发现正在细胞程序死亡的哺乳动物线粒体中两个蛋白的结合。 关于在活体细胞中蛋白浓度及运动的信息，则可以通过精确的GFP变异体光漂白获得。荧光分子例如GFP当受到照射时会发生光损伤，后者是当光损伤发生太快而来不及获取影像时造成的现象。 目前使用的绝大多数GFP变异体被选择用于慢速光漂白，这样材料可以在充裕的时间段内被显微观察。激光定点大剂量照射，可以用来光漂白一个细胞内的GFP分子。细胞的其它部分GFP运动到被照射的区域后就可以被观测到。光漂白后荧光恢复（FRAP）的速率可以给出扩散系数的预测以及运动的GFP的含量的指标。 一个相关技术是GFP光激活，在一个很小的

23、区域内，给予GFP一股蓝光的脉冲，受照射的GFP分子激发红光，这样可以观察到发射红光分子的运动速率。 这些技术已被用于测量动物线粒体内及单个大肠杆菌细胞内GFP及GFP融合蛋白的扩散，同样，也应该可以应用于植物质体、线粒体和核。 近期，由于应用多光子激发，这种方法得到改进，光漂白的电压可以更为精细，利于计算扩散系数。 FRAP和另一种相关技术，光漂白荧光丢失（FLIP）可以揭示两个区室间是否有流动发生。 FRAP和FLIP在研究动物细胞中高尔基体/ER的交流非常有用。 在植物中，FRAP和FLIP的第一次应用是检验质体是否通过狭窄的连接结构(stromules)交换蛋白分子，这种结构是GFP定位于质体基质时发现的。激光照射两个相连质体中某个质体内的GFP，一开始造成被照射的质体丢失荧光。 六秒后，被照射的质体荧光增强而没有照射的质体荧光减弱。 在一个FLIP试验中，连接两个相连质体的通路被反复照射，因而穿越