iTRAQ多重化学标记串联质谱技术在比较蛋白质组学中的应用

1、程菌的稳定性有很大的影响,上述影响质粒稳定性的各种因素在不同菌种中可能有不同作用,为了提高基因工程菌的稳定性,对各种进行条件优化是必要的。参考文献1ZJohansson A et al.Acta Vet Scand,2005,46(4:2412472刘芳等.清华大学学报(自然科学版,1997,37(6:46493史悦等.中国生物工程杂志,2005,25(8:70754袁辉等.东南大学学报(医学报,2004,23(4:2172205Aguirre-Ramirez M et al.Can J Microbiol,2006,52(1:24306刘志伟等.微生物学通报,2001,28(2:86897陆

2、军等.吉林大学自然科学学报,1997,(4:75788Martin GJ et al.J Ind Microbiol Biotechnol,2006,33:8348449Cheng CY et al.Biotechnology and Bioengineering,1997,56(1:233110袁其朋等.北京化工大学学报,2002,29(2:202311孙进等.药物生物技术,1999,6(4:24925412陈新爱等.化工学报,2003,54(7:1021102413喻国策等.过程工程学报,2001,l(2:18518814钟根深等.中国生物工程杂志,2005:273l15Katz JM e

3、t al.J Infect Dis,1997,175(2:352363文章编号:1000-1336(200605-0453-04iTRAQ 多重化学标记串联质谱技术在比较蛋白质组学中的应用李伟(上海交通大学生命学院系统生物研究所,上海200240摘要:研究不同生理和病理条件下细胞内蛋白质的含量和状态变化是比较蛋白质组学的核心内容。要揭示上述动态过程往往需要进行多个样品的同步比较分析。近年来,在体内和体外同位素标记基础上,用多维液相色谱分离多肽,进而用串联质谱进行相对定量的分析方法已成为高通量比较蛋白质组研究的主要手段之一。该文就目前唯一一种可以进行四重蛋白质样品同步比较的iTRAQ 标记-串联

4、质谱分析技术进行综述。关键词:比较蛋白质组学;iTR AQ ;多维液相色谱;串联质谱;多重同步分析中图分类号:Q51收稿日期:2006-05-17上海交通大学科研启动基金(No.交财A2338B作者简介:李伟(1967,男,博士,副教授,E-mail :li-wei近年来,为满足定量蛋白质组学研究的需要,可用于通过质谱分析进行蛋白质定量的相关标记技术发展迅速。包括同位素编码的亲和标签(Iso-tope-coded affinity tags ,ICAT、代谢标记(meta-bolic labellling和在培养过程中使用稳定性同位素标记的氨基酸(stable isotope labeling

5、 of amino acids in culture ,SILAC等使来自两种不同样品的蛋白质可以通过质谱进行含量比较。带有不同同位素标记的两种样品中的蛋白质经过胰蛋白酶水解产生的多肽,可以通过质谱分析比较氨基酸序列相同但分子量不同的多肽所产生离子的强度,从而了解多肽所代表的相应蛋白质的相对含量。iTRAQ T M 是美国应用生物系统公司(Applied Biosys-tems Inc ,ABI最新推出的一种多肽体外标记试剂,由于采用了4种同位素编码的标签,通过特异性标记多肽的氨基基团和串联质谱分析,可同时比较4种不同样品中蛋白质的相对水平。1.iTRAQ 多重化学标记-串联质谱分析的基本原理

6、iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation试剂,是一种在ICAT 基础上发展起来的可进行四重样品标记,以便用串联质谱进行丰度比较分析的氨基反应试剂(其标记和分析的原理如图1和图2所示。ICAT 是为了能够用质谱同时进行两个样品中相同多肽的丰度比较分析而开发出来的体外化学标记技术1。其最初的版本是一种用带有8个氘原子(又称重试剂,heavyreagent或带有8个氢原子的化合物(又称轻试剂,light reagent标记多肽,较新的版本重试剂带有9个13C ,轻试剂带有9个12C 。由于重试剂和轻试剂分子量相差8道尔顿(

7、Da 或9Da ,因此通过液相层析串联质谱(LC-MS 分析,可同时比较两个样品中带有不同标记的同种多肽的相对丰度。ICAT 技术虽然使两个样品同步分析成为可能,但也存在一些缺陷,具体表现在:(1标记步"""""""""""""""""""""""""""""""""&

8、quot;""""""""""""骤耗时较长;(2只能标记带有还原型半胱氨酸的多肽;(3需要进行繁琐的亲和富集和裂解步骤;(4不能进行34重样品标记。因此,ICAT仍不能满足多重复合分析的需要。iTRAQ试剂由四4种分子量均为145Da的等量异位标签(Isobaric tag分子组成,标签分子分别由质量为114、115、116、117Da的报道基团,质量为31、30、29、28Da的质量平衡臂(balance arm和一个相同的多肽反应基团组成。iTRAQ与ICAT方法相比有

9、如下优点:(1可与多肽的氨基端或多肽链赖氨酸残基上的氨基基团发生共价反应。(2标记过程更简单,反应速度快,标记完全,标记效率可高达97%以上,质谱检测更为灵敏。(3标记后在RP-HPLC上的保留峰位相同,而且同一种多肽的离子化程度十分接近。(44种同位素在标记相同多肽后进行第一级质谱检测时的分子量完全相同,这不仅可以简化谱的复杂程度,而且在同一峰位上的叠加效应可以提高离子的强度。(5在碰撞诱导的解离(collision induced dissociation,CID后进行第二级质谱分析时,带不同同位素标签的同一多肽产生质量为114,115,116和117Da的报道离子(reporter io

10、n,通过比较报道离子的丰度可获得样品间相同多肽的丰度差异,低分子量区是质谱定性(质量确定和定量(丰度比较较为准确的区域。(6报道离子所代表多肽的丰度比较和多肽前体的序列可在一次MS/MS过程中同时获得,其大致的标记和分析过程是:将4个蛋白质样品分别进行还原和烷基化,经胰蛋白酶水解后,分别用4种不同的iTRAQ试剂进行标记,将所有样品混合,然后经非在线或在线的液相(LC分离,并用串联质谱方法对在第一级质谱检测到前体离子(precursor ion进行碰撞诱导的解离,产物离子通过第二级质谱进行分析。第二级质谱可同时检测到质量相差1Da的114,115,116和117Da4种报道离子和被标记多肽肽键

11、断裂产生的离子串(product ion series。前者代表不同样品中相同多肽的丰度,后者可通过对蛋白质序列数据库的搜索确定蛋白质前体的身份。美国Wu等2对iTRAQ-MS/MS、ICAT-MS/MS和2D-DIGE等研究方法在比较蛋白质组学上应用的实际效果进行了评估,证明iTRAQ-MS/MS是最为灵敏的方法,由于iTRAQ试剂可以标记胰蛋白酶消化后的每一个多肽片段,因此较ICAT-MS/MS方法能获得更好的蛋白质序列覆盖率和比较蛋白质组覆盖率。但总的来说,iTRAQ-MS/MS、ICAT-MS/MS和2D-DIGE获得的比较蛋白质组数据既有交叉,又能在一定程度上互为补充。Chong等3

12、利用啤酒酵母等3种模式微生物对用iTRAQ-MS/MS技 术图1iTRAQ化学标记试剂的结构及分析原理示意图4进行蛋白质相对和绝对定量分析的重复性进行了研究。结果表明,通过iTRAQ-MS/MS 技术得到的蛋白质定量值在多次上样分析间重复性很好,变异系数在0.040.14之间,平均变异系数为0.09。多次重复分析可以提高蛋白质组分析的覆盖率和定量的准确性。2.iTRAQ-MS/MS 在生命科学领域的应用自从2004年5月份iTRAQ 试剂在市场上推出以来,利用这种多重标记技术进行多个样品中蛋白质相对丰度比较分析的研究报道迅速增加。iTRAQ-MS/MS 的一个显著优点是可以同时获得四重样品中多

13、肽身份和相对丰度的信息,从而大大提高分析的可信度。诸多的研究已经证明,iTRAQ-MS/MS 是研究细胞和组织不同生理状态或比较正常和不同病理状态下蛋白质水平差异的一种有效方式。Ross 等4率先用iTRAQ-MS/MS 技术比较了野生型啤酒酵母和两种基因缺陷型突变体蛋白质表达的差异,证明该技术不仅可提高蛋白质组分析的覆盖率,而且可改善肽链断裂模式,在加入体外合成且经一种iTRAQ 标记的多肽标准品后,还可进行蛋白质的定量。Aggarwal 等5比较了用2D-DIGE 和iTRAQ-MS/MS 方法研究rhsA 元件表达不同的大肠杆菌菌体内蛋白质表达水平的差异,结果发现前者的变异系数(coef

14、fient of varia-tion ,CV小于0.31,而后者则小于0.24。在另外一项研究中,该研究小组6用iTRAQ-MS/MS 在上述体系中找到了5068个来自780种蛋白质的表达有差异的多肽,其中包括一些转录因子等低丰度蛋白质,65%以上的蛋白质有2个以上的高可信度多肽与其匹配(P<0.05。Corvey 等7用iTRAQ-MS/MS 研究了不同碳源条件下人类共生微生物菌群中的一种真菌(Candida albicans 细胞中Snf1p 激酶复合物CaKis2P 亚基的含量变化,结果用酵母双杂交方法得到了验证。Reinders 等8利用i-TRAQ-MS/MS 和2D-DIG

15、E 找到了黏菌中心复合体中以往未知的70多种新候选蛋白质。Wolff 等9用iTRAQ-MS/MS 方法研究了不同热激条件下枯草杆菌细胞内蛋白质的变化,发现了数种用二维电泳方法不能检测到的细胞内与氨基酸合成密切相关的酶的含量变化。Unwin 等11用一种类似干细胞的细胞系模型(FDCP -mix,研究了在白血病致癌基因TEL/PDGFR 表达和不表达情况下细胞内蛋白质水平图2iTRAQ/MS/MS 分析示例10Mass(m/z,质量(质量/电荷;Intensity ,离子强度 。表达的差异。结果表明,iTRAQ标记多肽十分完全,由于来自4组蛋白质样品的同种多肽在相同质荷比(m/z的峰位出现,从

16、而使多肽的总离子强度提高,并且只需一次MS/MS分析,即可获得多肽身份以及4个样品中该多肽的相对丰度信息。通过iTRAQ-MS/MS分析,该研究小组从总细胞裂解液中鉴别出347种蛋白质,其中有100种蛋白质在表达水平上存在明显差异。该研究小组12还利用iTRAQ-MS/MS技术,对长期更替造血干细胞和非长期更替前体细胞的蛋白质表达谱进行了比较,通过二维液相分离-串联质谱分析,鉴定出948种蛋白质,其中145种蛋白质在表达水平上存在明显差异。Cong等13利用iTRAQ-MS/ MS技术,研究了人的WI38成纤维细胞系在4种不同生长状态下蛋白质表达谱的差异,鉴定出240种蛋白质,其中132种蛋白

17、质存在表达差异。他们选择波形蛋白(vimentin、HSP90和I型胶原3种蛋白质进行了Western验证,得到的结果与iTRAQ-MS/MS相似。DeSouza等14同时用i-TRAQ-MS/MS和cICAT-MS/MS两种方式比较了子宫内膜癌组织和正常组织中蛋白质表达的差异,找到癌组织中6种表达显著上调的蛋白质和3种表达显著下调的蛋白质。其中伴侣蛋白10 (chaperonin10通过Western和免疫组化得到了验证。在细胞器蛋白质组研究方面,Chen等15用iTRAQ-MS/MS监测,在胰腺酶原颗粒外膜提纯过程中膜蛋白的回收率和其他蛋白质污染情况。在体液比较蛋白质组方面,Hardt等1

18、6首次用iTRAQ-MS/MS方法,研究了腮腺唾液分泌物中分子量小于10kD多肽的生理节律性变化。发现有些多肽在一天内变化十分显著。Hirsch等17则利用iTRAQ-MS/MS,对大鼠肝脏局部热缺血处理后Kuppfer细胞内的蛋白质变化进行了研究,获得了总计1559种蛋白质的定量比较数据,其中HSP70和髓过氧化物酶的含量变化通过ELISA进一步得到了验证。iTRAQ标记试剂的另一个显著优点是,标记过程中仍能保留常见的翻译后修饰位点。Sachon 等18进行了几种标准磷酸化蛋白质的iTRAQ标记和定量分析,证明iTRAQ-MS/MS与IMAC (immobilized metal affin

19、ity chromatography等磷酸化多肽富集技术相结合,可用于磷酸化多肽的丰度比较分析。在另外一个研究中,Zhang等19在用iTRAQ标记EGF刺激前和刺激后不同时间点细胞内的蛋白质之后,用抗磷酸化酪氨酸的特异性抗体纯化磷酸化多肽,经IMAC富集后进行LC-MS/ MS分析获得了细胞内不同时间蛋白质酪氨酸磷酸化程度的动态变化结果,不仅找到了以往未知的18种磷酸化蛋白质,而且还找到了这些蛋白质序列上26个新的磷酸化酪氨酸位点。由此可见, iTRAQ-MS/MS技术在研究细胞内信号跨膜转导的磷酸化和去磷酸化过程中也是十分有用的。3.展望比较蛋白质组学是当今蛋白质组学研究的一个重要领域,比

20、较不同生理和病理状态下细胞内蛋白质表达和蛋白质修饰,对于揭示生物系统的复杂生理和病理过程具有十分重要的意义。目前进行比较蛋白质组研究的主要手段包括2D-DI-GE;或在不同原子量同位素的体内代谢标记和ICAT、iTRAQ等体外化学标记基础上,进一步利用在线或非在线多维液相分离后进行串联质谱分析的相对定量。迄今为止,多数方法只能进行两个蛋白质样品的同步比较,目前只有iTRAQ试剂能够同时进行4个样品的标记和同步分析比较。上述研究表明,尽管iTRAQ-MS/MS还有许多局限性需要进一步改进,但该技术已经展示出在生命科学研究中的应用价值。可以预见,iTRAQ-MS/MS在未来的比较蛋白质组研究中将得到更为广泛的应用,为了解蛋白质在生命过程中的动态变化做出积极贡献。参考文献1Gygi SP et al.Nat Biotechnol,1999,17(10:9949992Wu WW et al.J Proteome Res,2006,5(3:6516583Chong PK et al.J Proteome Res,2006,5(5:123212404Ross PL et al.Mol Cell Proteomics,2004,3(12:115411695Aggarwal K et al.Proteomics,2005,5(9:229723086Ch