疫苗工程2015

1、复旦大学医学院免疫学系高波13号楼10楼1019Edward Jenner(1749-1823)Louis Pastuer(1822-1895)凡具有抗原性接种于机体可产生特异的凡具有抗原性接种于机体可产生特异的自动免疫力，可抵御感染病的发生或流自动免疫力，可抵御感染病的发生或流行，统称为行，统称为疫苗疫苗细菌菌苗细菌菌苗病毒、立克次体疫苗病毒、立克次体疫苗毒素类毒素毒素类毒素1、减毒活疫苗、减毒活疫苗麻疹、风疹、腮腺炎疫苗等麻疹、风疹、腮腺炎疫苗等2、细菌或病毒灭活疫苗、细菌或病毒灭活疫苗甲肝疫苗等甲肝疫苗等3、多糖疫苗、多糖疫苗细菌的多糖荚膜细菌的多糖荚膜4、组分疫苗（亚单位疫苗）、组分疫

2、苗（亚单位疫苗）流感疫苗流感疫苗5、基因工程疫苗、基因工程疫苗病毒载体疫苗、基因缺失疫苗等病毒载体疫苗、基因缺失疫苗等6、合成肽疫苗、合成肽疫苗实验室研究阶段实验室研究阶段7、抗独特型抗体疫苗、抗独特型抗体疫苗8、核酸疫苗、核酸疫苗1.1 疫苗防病的历史渊源疫苗防病的历史渊源以毒攻毒以毒攻毒天花人痘接种法天花人痘接种法牛痘苗牛痘苗天花的消灭天花的消灭1.2 微生物学的黄金时代和微生物学的黄金时代和第一次疫苗革命第一次疫苗革命Leeuwenoek 1676年年 显微镜显微镜Pasteur 发酵、霍乱、炭疽、狂犬病发酵、霍乱、炭疽、狂犬病Koch 染色、固体培养基染色、固体培养基Calmette、

3、Guerin 卡介苗卡介苗 德国细菌学家贝林（德国细菌学家贝林（Emil Adolf von Behring，18541917） 法国微生物学家巴斯德法国微生物学家巴斯德(Louis Pasteur,1822-1893） 1.3 历史上的重大疫苗事故历史上的重大疫苗事故和灾难和灾难1.4 以重组以重组DNA技术为代表技术为代表的第二次疫苗革命的第二次疫苗革命化学化学生物化学生物化学遗传学遗传学免疫学免疫学1986年用基因工程制备的乙年用基因工程制备的乙型肝炎表面抗原获得成功并型肝炎表面抗原获得成功并正式作为肝炎疫苗用于临床正式作为肝炎疫苗用于临床1.4.2 化学和蛋白质化学技术化学和蛋白质化学

4、技术1.4.3 免疫学的贡献免疫学的贡献1.4.1 重组重组DNA技术技术1.5 疫苗对消灭和控制传染疫苗对消灭和控制传染病的不朽功绩病的不朽功绩 改善卫生条件改善卫生条件 使用特异的治疗使用特异的治疗 有效的疫苗接种有效的疫苗接种下呼吸道感染下呼吸道感染1(7发达国家发达国家)腹泻腹泻2麻疹麻疹4结核结核5疟疾疟疾6发展中国家十大致死性疾病发展中国家十大致死性疾病启用年份启用年份疾病名称疾病名称疫苗型别疫苗型别1721天花天花“人痘人痘”活天花病毒活天花病毒1798天花天花“天然减毒天然减毒”痘苗病毒痘苗病毒1885狂犬病狂犬病“不同程度不同程度”减毒和灭活疫苗减毒和灭活疫苗1896伤寒、霍

5、乱伤寒、霍乱灭活全菌灭活全菌1897鼠疫鼠疫灭活全菌灭活全菌1923白喉白喉部分纯化的甲醛脱毒类毒素部分纯化的甲醛脱毒类毒素1926百日咳百日咳灭活全菌灭活全菌1926破伤风破伤风部分纯化的甲醛脱毒类毒素部分纯化的甲醛脱毒类毒素1927结核结核活减毒活减毒BCG株株1936黄热病黄热病活减毒病毒活减毒病毒1936流感流感灭活全病毒灭活全病毒1938斑疹伤寒斑疹伤寒灭活全普氏立克次体灭活全普氏立克次体启用年份启用年份疾病名称疾病名称疫苗型别疫苗型别1943流感流感灭活完整（灭活完整（whole）病毒）病毒1946肺炎肺炎六价多糖疫苗六价多糖疫苗1955小儿麻痹小儿麻痹灭活病毒灭活病毒1957狂犬

6、病狂犬病灭活病毒、鸭胚培养灭活病毒、鸭胚培养1961小儿麻痹小儿麻痹活减毒病毒活减毒病毒1963麻疹麻疹灭活病毒和活减毒病毒灭活病毒和活减毒病毒1967腮腺炎腮腺炎活减毒病毒活减毒病毒1969风疹风疹活减毒病毒活减毒病毒1972流脑流脑纯化多糖纯化多糖A和和C型型1974乙脑乙脑灭活病毒灭活病毒1976狂犬病狂犬病灭活病毒、人二倍体细胞培养灭活病毒、人二倍体细胞培养1977肺炎球菌肺炎肺炎球菌肺炎14价纯化多糖价纯化多糖启用年份启用年份疾病名称疾病名称疫苗型别疫苗型别1980腺病毒肺炎、伤寒腺病毒肺炎、伤寒活减毒病毒活减毒病毒1981乙型肝炎乙型肝炎灭活、血源苗灭活、血源苗1982脑膜炎球菌脑

7、膜炎脑膜炎球菌脑膜炎纯化纯化A、C、Y、W135型多糖型多糖1983乙脑、水痘乙脑、水痘减毒活疫苗减毒活疫苗1984肺炎球菌肺炎肺炎球菌肺炎23价纯化多糖价纯化多糖1984B型流感嗜血杆菌型流感嗜血杆菌纯化多糖疫苗纯化多糖疫苗1986乙型肝炎乙型肝炎基因重组蛋白质疫苗基因重组蛋白质疫苗1987B型流感嗜血杆菌型流感嗜血杆菌多糖多糖-白喉类毒素结合苗白喉类毒素结合苗1991甲型肝炎甲型肝炎减毒活疫苗和死疫苗减毒活疫苗和死疫苗1996百日咳百日咳无细胞百日咳蛋白质疫苗无细胞百日咳蛋白质疫苗1998轮状病毒腹泻轮状病毒腹泻减毒活疫苗减毒活疫苗1998回归热回归热纯化蛋白质疫苗纯化蛋白质疫苗1.5.1

8、 疫苗对控制传染病及疫苗对控制传染病及降低其死亡数的巨大作用降低其死亡数的巨大作用1.5.2 世界卫生组织的扩大世界卫生组织的扩大计划免疫措施（计划免疫措施（EPI）l 疫苗的冷藏和低温运输问题疫苗的冷藏和低温运输问题l 注射器的消毒和重复使用注射器的消毒和重复使用l 专业人员的训练和培养专业人员的训练和培养l EPI计划的监控、评估和反馈计划的监控、评估和反馈1.5.3 使用疫苗消灭传染病使用疫苗消灭传染病的可能性的可能性1.5.3.1 天花的消灭天花的消灭1977年年10月月26日日1979年年10月月26日日1.5.3.2 小儿麻痹症的消灭小儿麻痹症的消灭中国中国2000年年世界世界20

9、05年前年前1.5.4 21世纪面临的新挑战世纪面临的新挑战1.5.4.1 传染病仍然是导致死亡的主要病因传染病仍然是导致死亡的主要病因白喉、脊髓灰质炎、百日咳、乙型肝炎、破伤白喉、脊髓灰质炎、百日咳、乙型肝炎、破伤风、麻疹、结核风、麻疹、结核1.5.4.2 新发现的传染病新发现的传染病1973年年轮状病毒轮状病毒1977年年埃伯拉病毒、肺炎军团菌埃伯拉病毒、肺炎军团菌1981年年金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌1982年年O157：H7大肠杆菌大肠杆菌1983年年幽门螺杆菌、幽门螺杆菌、HIV1988年年丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒1.5.4.3 新回潮的传染病新回潮的传染病结核病结核病每年新发病人

10、每年新发病人1000多万，死亡多万，死亡300万万HIV感染并发、耐药性产生感染并发、耐药性产生1.5.4.4 与传染病有关的肿瘤与传染病有关的肿瘤肝癌肝癌乙肝病毒、丙肝病毒乙肝病毒、丙肝病毒胃癌胃癌幽门螺杆菌幽门螺杆菌子宫颈癌子宫颈癌HPV16、181.6 引发第三次疫苗革命的引发第三次疫苗革命的DNA疫苗疫苗流感病毒流感病毒DNA疫苗疫苗乙型肝炎乙型肝炎DNA疫苗疫苗艾滋病、流感、乙型肝炎、艾滋病、流感、乙型肝炎、单纯疱疹病毒、疟疾、癌单纯疱疹病毒、疟疾、癌胚抗原胚抗原DNA疫苗疫苗其中疟疾其中疟疾DNA疫苗进入疫苗进入III期临床试验期临床试验2.1 免疫系统免疫系统2.1.1 先天性免

11、疫系统先天性免疫系统2.1.2 获得性免疫系统获得性免疫系统2.2 免疫活性细胞免疫活性细胞2.2.1 B淋巴细胞淋巴细胞2.2.2 T淋巴细胞淋巴细胞2.2.3 抗原递呈细胞抗原递呈细胞2.3 疫苗和免疫反应疫苗和免疫反应2.3.1 感染和免疫反应感染和免疫反应2.3.2 死疫苗和体液免疫反应死疫苗和体液免疫反应2.3.3 减毒活疫苗和细胞免疫反应减毒活疫苗和细胞免疫反应2.3.4 口服疫苗和粘膜免疫反应口服疫苗和粘膜免疫反应2.3.5 多糖疫苗的非胸腺依赖性反应多糖疫苗的非胸腺依赖性反应2.3.6 DNA疫苗的细胞和体液免疫反应疫苗的细胞和体液免疫反应2.4 疫苗有效免疫反应的基疫苗有效免

12、疫反应的基本要素本要素2.4.1 疫苗的免疫原性疫苗的免疫原性 化学组成与结构不同的抗原能引起化学组成与结构不同的抗原能引起不同类型的免疫反应不同类型的免疫反应 抗原的剂量也对免疫反应的形成有抗原的剂量也对免疫反应的形成有重要影响重要影响 感染源入侵的途径也决定了人体相感染源入侵的途径也决定了人体相应的免疫反应类型应的免疫反应类型 疫苗的免疫原性还和佐剂的使用密疫苗的免疫原性还和佐剂的使用密切相关切相关2.4.2 疫苗的免疫记忆性疫苗的免疫记忆性 记忆性记忆性B细胞细胞 记忆性记忆性T细胞细胞优质制造规范优质制造规范 (good manufacture pratice, GMP)优质实验室规范

13、优质实验室规范 (good laboratory pratice, GLP)优质临床试验规范优质临床试验规范 (good clinical pratice, GCP)3.1 疫苗研制的法规疫苗研制的法规3.1.1 生产疫苗的厂房、车间和设备生产疫苗的厂房、车间和设备3.1.2 原材料原材料3.1.3 文件制度文件制度3.1.4 质量控制（质量控制（QC）3.2 微生物和细胞的培养微生物和细胞的培养3.2.1 菌种和种子细胞的制备菌种和种子细胞的制备3.2.2 细菌的发酵培养细菌的发酵培养3.2.3 酵母培养酵母培养3.2.4 细胞培养细胞培养3.3 培养物固、液相分离和培养物固、液相分离和细胞

14、的破碎细胞的破碎3.3.1 离心技术离心技术3.3.2 过滤过滤3.3.3 细胞的破碎细胞的破碎3.4 疫苗抗原成分的纯化疫苗抗原成分的纯化3.4.1 层析技术层析技术l离子交换层析离子交换层析l疏水性树脂层析疏水性树脂层析l分子筛分子筛l亲和层析亲和层析l聚焦层析聚焦层析l碱性磷酸钙层析碱性磷酸钙层析3.4.2 生物大分子提纯方案的设计生物大分子提纯方案的设计3.4.3 疫苗蛋白质抗原的提纯疫苗蛋白质抗原的提纯3.4.4 多糖抗原的提纯多糖抗原的提纯3.4.5 内毒素的清除内毒素的清除完全福氏佐剂（完全福氏佐剂（CFA）：密度较小的矿物）：密度较小的矿物油、干的死分枝杆菌常用死结核杆菌以及油

15、、干的死分枝杆菌常用死结核杆菌以及乳化剂如乳化剂如Arlacel A组成组成不完全福氏佐剂（不完全福氏佐剂（IFA）：不含分枝杆菌）：不含分枝杆菌4.1 植物佐剂植物佐剂 加强细胞的吞噬作用加强细胞的吞噬作用 刺激免疫细胞产生各种细胞因子刺激免疫细胞产生各种细胞因子 刺激抗体产生刺激抗体产生皂角素成分：皂角素成分：Quil A、QS-214.2 细菌佐剂细菌佐剂4.2.1 霍乱毒素（霍乱毒素（CT）和大肠杆菌不耐热）和大肠杆菌不耐热毒素（毒素（LT）4.2.2 重组百日咳毒素（重组百日咳毒素（PT）4.2.3 B群流脑杆菌的外膜小体（群流脑杆菌的外膜小体（OMV）4.2.4 卡介苗（卡介苗（B

16、CG）4.2.5 细菌脂多糖（细菌脂多糖（LPS）4.3 人工合成佐剂人工合成佐剂4.3.1 脂质体脂质体4.3.2 MF59佐剂佐剂4.3.3 免疫刺激复合物佐剂免疫刺激复合物佐剂4.4 铝佐剂及其它无机成分佐剂铝佐剂及其它无机成分佐剂4.4.1 铝佐剂（铝佐剂（alum）十二水和硫酸铝钾十二水和硫酸铝钾部分纯化的蛋白抗原、破伤风类毒素或白部分纯化的蛋白抗原、破伤风类毒素或白喉类毒素在磷酸根和碳酸氢根存在下沉淀喉类毒素在磷酸根和碳酸氢根存在下沉淀出的含磷酸铝的出的含磷酸铝的混合物混合物4.4.2 磷酸钙佐剂磷酸钙佐剂抗原在抗原在0.07M的的Na2HPO4 H2O的溶液中透的溶液中透析后，快

17、速加入析后，快速加入0.07M的的CaCl2 H2O溶液，溶液，调节调节pH至至6.87.0，形成的凝胶用生理盐，形成的凝胶用生理盐水洗后，再重悬于生理盐水中水洗后，再重悬于生理盐水中4.5 细胞因子佐剂细胞因子佐剂4.5.1 细胞因子调节免疫功能的机理细胞因子调节免疫功能的机理4.5.2 细胞因子的佐剂作用细胞因子的佐剂作用4.6 核酸佐剂核酸佐剂4.6.1 CpG基序：基序：5-X1X2CGYY-34.6.2 使用能表达与免疫相关的细胞因子的使用能表达与免疫相关的细胞因子的核酸载体作为佐剂核酸载体作为佐剂4.6.3 双链双链RNA长期以来被认为是非常良长期以来被认为是非常良好的干扰素诱生剂

18、好的干扰素诱生剂4.7 投递系统投递系统减毒的细菌或病毒与抗原的重组减毒的细菌或病毒与抗原的重组DNA投投递系统递系统某些化学物质某些化学物质 能在体内共存的可生物能在体内共存的可生物降解的聚合物（降解的聚合物（BBP），例如），例如PLGA、PLG、脂质体、葡聚糖、淀粉等、脂质体、葡聚糖、淀粉等4.8 新佐剂的选择和研究方向新佐剂的选择和研究方向疫苗的成分疫苗的成分免疫途径免疫途径5.1 实验动物的管理实验动物的管理5.1.1 实验动物管理的人事实验动物管理的人事5.1.2 实验动物的饲养和管理实验动物的饲养和管理5.1.3 感染动物室的分级及要求感染动物室的分级及要求5.2 实验动物模型实

19、验动物模型u 天然的动物模型天然的动物模型u 诱导的动物模型诱导的动物模型u 阴性模型阴性模型u 孤寡模型孤寡模型5.3 实验动物在疫苗实验动物在疫苗研制中的应用研制中的应用5.3.1 一般毒性试验一般毒性试验5.3.2 特殊毒性试验特殊毒性试验5.3.3 毒力实验毒力实验5.3.4 疫苗的效力实验疫苗的效力实验5.3.5 多克隆和单克隆抗体的制造多克隆和单克隆抗体的制造5.3.6 转基因动物的应用转基因动物的应用5.3.7 基因敲除动物的应用基因敲除动物的应用以往疫苗成功的原因在于它能有效地诱导机以往疫苗成功的原因在于它能有效地诱导机体产生保护性抗体体产生保护性抗体然而对胞内菌如结核杆菌、利

20、什曼原虫及寄然而对胞内菌如结核杆菌、利什曼原虫及寄生虫等这些抗体几乎不起作用生虫等这些抗体几乎不起作用对对HBV、HCV、HIV、疟原虫等感染需要细、疟原虫等感染需要细胞和体液免疫的双重介导胞和体液免疫的双重介导传统疫苗传统疫苗新型疫苗新型疫苗成分成分死疫苗死疫苗/减毒活疫苗或减毒活疫苗或重组亚单位免疫重组亚单位免疫编码抗原的核酸或细编码抗原的核酸或细胞疫苗胞疫苗机制机制抗原蛋白刺激机体产生抗原蛋白刺激机体产生中和性保护抗体中和性保护抗体不仅产生保护性抗体不仅产生保护性抗体还激发特异细胞免疫还激发特异细胞免疫作用作用起一定预防作用起一定预防作用不仅预防更起特异性不仅预防更起特异性治疗作用治疗作

21、用所谓核酸疫苗（所谓核酸疫苗（nucleic acid vaccine），是），是将含编码外源蛋白基因的质粒将含编码外源蛋白基因的质粒DNA直接导入直接导入动物组织，外源基因在体细胞表达后，产物动物组织，外源基因在体细胞表达后，产物被递呈，与被递呈，与MHC结合，刺激机体产生体液结合，刺激机体产生体液和细胞免疫应答，又称裸和细胞免疫应答，又称裸DNA疫苗疫苗 接种后，蛋白抗原在宿主细胞内表达，与病接种后，蛋白抗原在宿主细胞内表达，与病原的自然感染相似，可以诱导细胞和体液免疫原的自然感染相似，可以诱导细胞和体液免疫 外源基因在体内存在较长时间，不断表达外外源基因在体内存在较长时间，不断表达外源蛋

22、白，持续刺激产生较强和较持久的免疫应源蛋白，持续刺激产生较强和较持久的免疫应答答 具有共同的理化特性，可将含不同抗原基因具有共同的理化特性，可将含不同抗原基因的质粒混合进行联合免疫的质粒混合进行联合免疫 质粒载体没有免疫原性，可以反复使用质粒载体没有免疫原性，可以反复使用T细胞疫苗是指将细胞疫苗是指将T细胞或体外细胞或体外T细胞表位多细胞表位多肽刺激产生的肽刺激产生的T细胞作为疫苗接种，用于治细胞作为疫苗接种，用于治疗某些自身免疫性疾病疗某些自身免疫性疾病治疗某些自身免疫性疾病治疗某些自身免疫性疾病T细胞引起的迟发型变态反应可能是某些自身细胞引起的迟发型变态反应可能是某些自身免疫病的病因免疫病

23、的病因动物实验中，把动物体内引起疾病的动物实验中，把动物体内引起疾病的T细胞移细胞移入其它健康动物体内，也能引起疾病入其它健康动物体内，也能引起疾病如果把致病的如果把致病的T细胞灭活后注入体内，即使致细胞灭活后注入体内，即使致病病T细胞再移入体内，也不再引起疾病细胞再移入体内，也不再引起疾病小鼠小鼠EAE中已成功，还用于人类中已成功，还用于人类MS治疗某些病毒性疾病治疗某些病毒性疾病用多肽在体外诱导产生特异性用多肽在体外诱导产生特异性CTL，经克隆、扩，经克隆、扩增、筛选和鉴定后，仅将增、筛选和鉴定后，仅将MHC-I类限制的类限制的CD8T细胞输入机体，诱导细胞免疫应答产生细胞输入机体，诱导细

24、胞免疫应答产生转染了转染了HCV基因的小鼠骨髓瘤基因的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞皮下注细胞皮下注射，发现射，发现MHC-I限制的限制的CTL表位多肽体外诱导的表位多肽体外诱导的特异性特异性CTL，在体内外对，在体内外对HCV感染细胞均具有感染细胞均具有杀伤作用杀伤作用DC是目前发现的功能最强的是目前发现的功能最强的APC，也是唯一能激活初始，也是唯一能激活初始T细胞的细胞的APC应用抗原或抗原多肽体外冲击致敏应用抗原或抗原多肽体外冲击致敏DC，然后回输或免疫接，然后回输或免疫接种荷瘤宿主或带病毒特异性抗原的宿主，进行免疫治疗种荷瘤宿主或带病毒特异性抗原的宿主，进行免疫治疗利用利用DC与肿瘤细胞融

25、合成为新型带有与肿瘤细胞融合成为新型带有DC功能及肿瘤特异抗功能及肿瘤特异抗原的融合细胞瘤苗原的融合细胞瘤苗利用病毒载体将带有肿瘤或病毒抗原的编码基因转染利用病毒载体将带有肿瘤或病毒抗原的编码基因转染DC，使之在使之在DC内持续表达相应特异性抗原，诱导产生特异性抗内持续表达相应特异性抗原，诱导产生特异性抗肿瘤或抗病毒免疫肿瘤或抗病毒免疫1、核酸疫苗的发展、核酸疫苗的发展用感染机体组织中提取出的用感染机体组织中提取出的DNA序列，序列，经调整后局部注射诱导保护性免疫反应经调整后局部注射诱导保护性免疫反应DNA免疫在动物模型中是有效的，但在人体免疫在动物模型中是有效的，但在人体肌注肌注DNA却不一

26、定能产生活跃的免疫反应却不一定能产生活跃的免疫反应只有针对乙型肝炎和疟疾的核酸疫苗在人体只有针对乙型肝炎和疟疾的核酸疫苗在人体中诱导了保护性的免疫反应中诱导了保护性的免疫反应2、治疗性疫苗的发展、治疗性疫苗的发展HIV、HBV、螺旋杆菌、粘膜念珠菌、螺旋杆菌、粘膜念珠菌、疱疹病毒、人乳头瘤病毒等疱疹病毒、人乳头瘤病毒等3、当今疫苗的进步、当今疫苗的进步肺炎链球菌的多价多糖疫苗自从肺炎链球菌的多价多糖疫苗自从1977年年在美国就已经通用，但在儿童中产生了在美国就已经通用，但在儿童中产生了一种不协调的免疫反应一种不协调的免疫反应七价肺炎链七价肺炎链球菌复合性多糖疫苗球菌复合性多糖疫苗流感疫苗是从鸡

27、胚中培养的注射用无活流感疫苗是从鸡胚中培养的注射用无活力流感病毒力流感病毒鼻内喷剂鼻内喷剂1、癌症、癌症小鼠胸腺肿瘤细胞传递到膜上表达的小鼠胸腺肿瘤细胞传递到膜上表达的GPI-B7-1蛋白，可保护小鼠对抗此种肿瘤蛋白，可保护小鼠对抗此种肿瘤黑色素瘤黑色素瘤ALVAC gp100基因、结直肠癌基因、结直肠癌ALVAC CEA-B7.1基因、乳腺癌基因、乳腺癌HER2/Neu等等2、自身免疫性疾病、自身免疫性疾病类风湿性关节炎（类风湿性关节炎（RA）多发性硬化（多发性硬化（MS）重症肌无力重症肌无力食物性过敏食物性过敏I型糖尿病型糖尿病吸毒、吸烟吸毒、吸烟动脉粥样硬化动脉粥样硬化避孕避孕3、针对大规模杀伤性、针对大规模杀伤性生物武器的疫苗生物武器的疫苗炭疽炭疽天花天花鼠疫鼠疫脊髓灰质炎脊髓灰质炎肠外给药，许多需要注射肠外给药，许多需要注射增大粘膜免疫和全身免疫增大粘膜免疫和全身免疫1、透皮性免疫预防、透皮性免疫预防动物研究已显示在局部应用疫苗后，有全身性和粘膜动物研究已显示在局部应用疫苗