南方医科大学微生物试验报告

1、2016年南方医科大学医学微生物学实验报告 日期2016年5月22号 题目 脓汁和典便标本中病原菌的检测 成绩 实验者 作者：马浩楠 3140020007 参与者名字： 马浩楠丁超王尧鑫桂义茁 年级专业 2014级医学影像专业 指导老师 罗军 一、实验目的 1 1、掌握培养基制备的原则和一般方法。 2 2、掌握病原菌的分离与培养方法。 3 3、掌握油镜的正确使用、细菌涂片标本的制备、革兰氏染色法，熟悉细菌基本形态。 4 4、熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。 5 5、掌握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。 6 6、熟悉药物敏感性试验方法的种类、原理及应用，掌握纸片扩

2、散法。 7 7、掌握玻片凝集试验的原理、方法、结果观察与判断。 二、实验器材 1 1、天平、称量纸、干粉培养基、锥形瓶、量筒、1515 支试管、试管架、试管筐、 5ml5ml 刻度吸管、平皿、洗耳球、酒精灯 2 2、脓汁标本 1 1 支，粪便标本 1 1 支；伊红美兰平板 2 2 个，营养琼脂平板 2 2 个，伊红美蓝平板 2 2 个，接种环，酒精灯 3 3、斜面 4 4 支、细菌分离培养物（上次实验平板） 4 4、斜面培养物 4 4 支，营养肉汤 4 4 支，生理盐水 2 2 支，镜油瓶、拭镜纸 1 1 套，吸水纸 1 1 本，载玻片 4 4 张，染色瓶，染色架 5 5、斜面培养物 4 4

3、支，营养肉汤培养物(菌液)4 4 支，半固体琼脂 4 4 支，营养琼脂平板 4 4 个，糖发酵管 1 1 套，抗菌素纸片 1 1 套，眼科银子 2 2 把 6 6、半固体培养物 4 4 支，药敏试验培养物 4 4 个，微量发酵管培养物 1 1 套。 三、方法与步骤 1 1、培养基的制备: 称量干粉培 养基(g)(g) 水量(ml)(ml) 煮沸(次) 分装(ml)(ml) 备注 营养琼脂 11.411.4 300300 3 3 瓶,500ml500ml 瓶，平板 营养琼脂 2.72.7 7070 3 3 5 5 1414 支 X3,X3,中试管，斜面 营养肉汤 1.31.3 6060 1 1

4、3 3 2020 支 X2,X2,小试管，肉汤 半固体琼脂 1.71.7 6060 3 3 4 4 1414 支 X3,X3,小 试管，高层 (1)营养琼脂培养基的制备：称量11.4g琼脂，置于三角烧瓶中，加入300ml蒸储水，分2瓶装，用于倒平板。 (2)营养琼脂培养基的制备(用于制作斜面)：称量2.9g琼脂，置于三角烧瓶中，加入 75ml蒸储水，放在电炉上，先后煮沸3次，分15支中试管装，每支试管5ml。 (3)肉汤培养基的制备(用于制作液体培养基)：称量1.1g琼脂，置于三角烧瓶中，加 入50ml蒸储水，放在电炉上，煮沸1次，分15支小试管装，每支试管5ml。 (4)半固体琼脂培养基的制

5、备：称量1.7g琼脂，置于三角烧瓶中，加入60ml蒸储水，放 在电炉上，先后煮沸3次，分15支中试管装，每支试管4ml。 2 2、细菌的分离培养 平板划线分离法 甲 f f 脓汁标本-营养琼脂平板（黄色）乙-脓汁标本-营养琼脂平板（黄色）内一粪便标本一伊红美蓝平板（紫色）丁一粪便标本一伊红美蓝平板（紫色）步骤：接种环烧灼灭菌。取标本 3 36ul6ul。平板采光，当看到平板表面象镜面有反光的时候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，以便控制划线。 接种环与平板呈 30304040 度角，在平板表面上方，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于 3030

6、 条。烧掉 接种环上多余的标本。转动平板，通过第一区 5 57 7 次，使接种环重新沾上少 量细菌，同样的方法划第二区。转动平板，接种环通过第二区 1 1 次，划第三区。转动平板，接种环通过第三区 1 1 次，划第四区。划第五区。 3 3、细菌的纯培养 斜面接种分工 甲 f f 普通平板黄色菌落-1 1 支斜面乙普通平板白色菌落1 1 支斜面 内-EMWEMW 板-紫黑菌落-1 1 支斜面丁-EMBEMB 平板-粉红菌落-1 1 支斜面 方法：接种环套住菌落轻刮取菌-接种环取菌后，伸入斜面底部，自下向上 先拉条细菌接种线-再伸入底部，自下向上，作蜿蜒划线-细菌涂布接种在斜面培养基的表面斜面正面

7、上 2/32/3 作标记：组号、颜色收集平板-灭菌桶内 （平板底部朝下，盖朝上放置）速送灭菌室-高压蒸汽灭菌-洗刷。 4 4、细菌的形态学检查 涂片干燥固定染色 （1 1）涂片-干燥-固定 甲 f f 黄色，紫黑。乙-白色，粉红。 丙-黄色，紫黑。丁-白色，粉红。 方法：涂片：接种环取盐水 3ulX23ulX2 滴，水滴间距小于 2cm;2cm;取菌苔少许（1mm1mm 小菌落半个）与盐水混匀，涂成大于 lcm2;lcm2;涂毕环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌。-干燥固定：手持载玻片-端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层 3 3 次，时间 2?32?3 秒钟。 革兰染色 涂

8、片-干燥-固定-结晶紫-初染 1 1 分钟-水洗-卢戈碘液-媒染 1 1 分钟-水洗95%95%乙醇月色约 2020秒钟一 7 7 尺洗一稀释品红一复染 1 1 分钟一水洗一吸干， 镜检。 油镜使用方法： 10X10X 物镜一看清标本一滴加香柏油一 100X100X 油镜一浸泡油中模糊物象-细调节调焦，观察物像-记录结果-关闭电源-擦镜纸拭去香柏油一 擦镜纸沾少许乙醇和乙醴（7:37:3）混合液擦拭-擦镜纸擦拭油镜。 5 5、液体培养基接种（肉汤接种）甲 f f 金黄色，乙-白色，丙-紫黑，丁-粉红。 方法：（1 1）接种环斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接种；（2 2）在管壁上，将接种

9、环内的菌膜拍破。退出接种环，烧灼灭菌；（3 3）标记：组号，颜色 6 6、细菌的生化试验等 （1 1）细菌的糖发酵实验： 在紫黑色的斜面培养基取适量菌落接种在含有葡萄糖的发酵管中，并做好 标记 在紫黑色的斜面培养基取适量菌落接种在含有乳糖的发酵管中，并做好标 记 在粉红色的斜面培养基取适量菌落接种在含有葡萄糖的发酵管中，并做好 标记 在粉红色的斜面培养基取适量菌落接种在含有乳糖的发酵管中，并做好标 记 步骤：用砂轮在糖发酵管液面上方 2 23cm3cm 处，切割一道切痕。两手握住发酵管将管子折断。管口烧灼灭菌。接种针斜面取菌，伸入培养基内，在管壁上，上下研磨接种。退出接种针，烧灼灭菌。管口朝向

10、相同，放置在平皿内。 （2 2）抗菌素敏感性试验 纸片扩散法 甲 f f 黄色菌液乙-白色菌液 丙-紫黑菌液丁-粉红菌液 方法： 先取-环菌液； 沿平板直径拉一条细菌接种线； 再取一环菌液； 旋转平板 9090 度角，拉另一条接种线， 使两条细菌接种线呈“十字形”； 然后在平板上半部， 作连续来回密集划线，每次划二分之一平板；旋转平板 9090 度角， 二次密集划线；旋转平板 9090 度角， 三次密集划线；旋转平板 9090 度角， 四次密集划线；设三点，呈等边三角距离；点距离平板边缘约 15mm;15mm; ?作标记：青、先、庆；？银子尖嘴朝下，夹取相应药物纸片的边缘，平贴在已设定的位置上

11、，轻轻按压纸片。 (3)(3)血浆凝固酶试验 步骤： 取二滴兔血浆置于洁净的玻片上。 分别用接种环取白色和金黄色菌苔(约 2 23 3 个菌落的菌量)与血浆研磨混合成直径 8 810mm10mm 勺一层薄菌膜。立即观察结果。 (4)(4)半固体穿刺接种法 用接种针取紫黑色菌落垂直刺入半固体培养基，再按原路返回，并做好标记 用接种针取粉红色菌落垂直刺入半固体培养基，再按原路返回，并做好标 记 步骤：接种针斜面取菌，从半固体中心，垂直刺入，到达培养基底部 5 5 分之 4 4 处，再循原来的路线，退出接种针。管口、接种针经火焰烧灼灭菌37c37c 下培养 18241824 小时。 7 7、细菌的血

12、清学试验、结果分析 玻片凝集试验 取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水 15ul15ul。远 端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清 15ul15ul, , 用接种环分别取粉红色菌苔，约 2 2 个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均匀。 载玻片来回倾侧，让菌液充分混匀，凝集速度更快、结果更清楚。 观察记录结果：菌液凝集者记为阳性，菌液均匀混浊记为阴性。 四、结果与讨论 (一)实验结果 1 1 . .洗手前后对比 图片分析：洗手图不是很理想，上面同学的洗手后与消毒后与预期的不一致，可能是操作不当引起的。 2 2 . .细菌的分离培养结果： (1)(1)脓汁标本在普通平板上有

13、黄色、白色两种菌落，菌落的色素是脂溶性的，是细菌本身的颜色。菌落直径 2mn2mn右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明。 (2(2)粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落，菌落色素是水溶性的，不是细菌本身的颜色，紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落，菌落直径 2?2?3mm3mm 粉红色菌落淡粉红色，半透明，直径 1?1?2mm.2mm. 图片分析：由于同学都是第一次划线，所以划线都不是很好。 3 3 .细菌的纯培养： 在斜面培养基上得到四种菌体的纯培养标本，从普通平板上挑取的黄色或白色 菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，黄色或白色。 从伊红美

14、蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌 落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、前者不透明，后者透明 图片分析：中间两组效果不好，可能来自于采菌过少或者划线操作不当 4,4,细菌的形态学检查 脓汁标本（左边为白色菌苔，右图为金黄色菌苔） 粪便标本(左图为粉红菌苔，右图为紫黑色菌苔) 镜下观察：用普通平板，从浓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为 G+G+求菌，排列不规则，呈葡萄用状，是典型的葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。 用伊红美蓝平板，从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。紫黑色菌落可能

15、是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，均为 G G- -杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。 6.6.细菌的生化试验等： (1)(1)半固体穿刺接种法 图片分析：实验效果与预期一致，但是拍摄效果不是很好 四组的半固体培养接种的培养图，由于拍摄效果不好，但是依然可以分辨生长的情况。 直线生长的表明无鞭毛。 细菌的糖发酵试验 糖发酵实验结果图.从下至上分别为: (粉红一乳糖粉红一葡萄糖紫黑一乳糖紫黑一葡萄糖) 编号 菌苔 糖发酵管 反应现象 结果描述 符号 甲 紫黑 糖发酵管变 黄色有气泡 分解 X X 糖产 酸又产气 乙 紫黑 糖发酵管变 黄色有气

16、泡 分解 X X 糖产 酸又产气 丙 粉红 糖发酵管变 黄色无气泡 分解 X X 糖产 酸/、产气 + + 丁 粉红 糖发酵管变 紫色无气泡 分解 X X 糖产 酸/、产气 - - +:产酸或阳性：产酸产气- -:阴性 紫黑细菌微型发酵关内液体变黄，产生气泡，气泡的高度分别为 10mnf10mnf 口 17mm17mm 说明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖，产酸产气；粉红细菌只分解葡萄糖，不产气，不分解乳糖。 (3)(3)抗菌素敏感试验结果 图片分析：.3.3 号同学划线最好，本人 4 4 号划线不好，还是没有划好。2 2 号同学效 果不好，可能取菌过少。 4:浓汁标本中白色菌落3:浓汁标本中

17、金黄色菌落 2:粪便标本中粉色菌落1:粪便标本中紫黑色菌落 药敏试验结果分析 青霉素 头抱曲松 庆大毒素 金黄色 + + + 白色 + + 紫黑 - + + 粉红 - + + -:耐药 士：中度敏感 十:敏感 白色细菌对对青霉素敏感，对头抱曲松中度敏感，对庆大毒素敏感 金黄细菌对青霉素敏感，对头抱曲松敏感，对庆大毒素敏感紫黑细菌对青霉素耐药，对头抱曲松敏感，对庆大毒素敏感粉红细菌对青霉素耐药，对头抱曲松敏感，对庆大毒素敏感（4 4）血浆凝固酶实验结果： 金黄色（左）与白色（右）菌苔 1 1、白色菌苔不发生凝块，容易涂抹。呈均匀乳白状态。 2 2、黄色菌苔能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原

18、转变为不溶性纤维蛋白，附着于菌体表面，形成凝块，涂抹不开。说明黄色细菌为致病菌。 7 7.玻片凝集试验: 由实验结果图可看到，生理盐水一端（左）不出现凝集，福氏志贺菌诊断血清一端（右）菌液虽然不是很不明显，但是可以看到任有少量絮状沉淀，表明为阳性。说明粉红菌为福氏志贺菌。 8.8.结论： 对照对照常见肠道感染细菌主要生化反应特征，血清学分析，说明黄色菌落是金黄色葡萄球菌；白色菌落是白色葡萄球菌；紫黑色菌落是大肠埃希菌；粉红色菌落是福氏志贺菌。 （二）实验讨论 1 1 . .分析： 制备好培养基后，首先采用平板划线分离法，从脓汁标本中分离出金黄色和白色两种菌落。显微镜下，这两株细菌均为 G+G+求菌，排列不规则，呈葡萄用状，是典型的葡萄球菌；结合菌落或菌苔颜色，这两株葡萄球菌分别是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。通过血浆凝固酶试验鉴别，金黄色葡萄球菌是致病菌。最后通过药敏试验，可见不同的抗生素所形成的抑菌圈不同，其中金黄色葡萄球菌对青霉素最敏感，而紫黑和粉红细菌对青霉素