爱爱医资源-分子细胞遗传学技术与产前诊断-PPT课件

1、分子细胞遗传学技术分子细胞遗传学技术与产前诊断与产前诊断南京大学医学院南京大学医学院王亚平王亚平2006年年11月月基因诊断的中心问题是认识基因诊断的中心问题是认识遗传变异遗传变异、基因突变基因突变及与及与表型表型之间的关系之间的关系一、分子细胞遗传学技术一、分子细胞遗传学技术w荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（fluorescence in site fluorescence in site hybridization, FISHhybridization, FISH）：用荧光物质标记特异性）：用荧光物质标记特异性DNADNA探针，探针，与中期细胞染色体或间期细胞核杂交，鉴别和确定出生缺与中

2、期细胞染色体或间期细胞核杂交，鉴别和确定出生缺陷、肿瘤细胞染色体异常，分辨率可达陷、肿瘤细胞染色体异常，分辨率可达5050500 kb. 500 kb. 荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（Fluorescence in site Fluorescence in site hybridization, FISHhybridization, FISH）的特异性）的特异性DNADNA探针探针 基因座特异性探针基因座特异性探针：克隆扩增获得。在基因制图方面的努：克隆扩增获得。在基因制图方面的努力，越来越多的这方面探针可以使用力，越来越多的这方面探针可以使用 着丝粒重复序列探针着丝粒重复序列探针：这些特

3、异性的探针可在中期染色体：这些特异性的探针可在中期染色体和间期细胞核中产生强烈信号，可以鉴别特异性染色体。和间期细胞核中产生强烈信号，可以鉴别特异性染色体。 全染色体涂染探针全染色体涂染探针：通过对来自：通过对来自特异性染色体分检库特异性染色体分检库或仅或仅含一条人类染色体的含一条人类染色体的杂种细胞杂种细胞DNA扩增制备。这种扩增制备。这种DNA序列的混合物与一条染色体上的多个位点同源。因此在中序列的混合物与一条染色体上的多个位点同源。因此在中期核内，整条染色体得以被涂染。通过使用不同的荧光素，期核内，整条染色体得以被涂染。通过使用不同的荧光素，在一个中期染色体涂片上可以鉴别几条不同的染色体

4、。在一个中期染色体涂片上可以鉴别几条不同的染色体。应用应用1515号染色体一基因特异性号染色体一基因特异性探针（红色）杂交确定其是否探针（红色）杂交确定其是否缺失；绿色探针鉴定缺失；绿色探针鉴定1515号染色号染色体着丝粒。体着丝粒。2424种不同染色体涂染探针杂种不同染色体涂染探针杂交得到的彩色染色体交得到的彩色染色体染色体技术的染色体技术的应用应用1 1inv(14)(p12q24)t(2; 11)(2q34; 11q13)细胞遗传学研究中染色体技细胞遗传学研究中染色体技术的应用术的应用FISHFISH技术检出技术检出t(2; 14)t(2; 14)染色体技术的染色体技术的应用应用2 2i

5、nv(9)(p12q13)分子细胞遗传学：分子细胞遗传学：DMD基因第基因第46号外显子缺失号外显子缺失细胞遗传学研究中染色体技术的应用细胞遗传学研究中染色体技术的应用9 9号染色体涂染探针杂交。号染色体涂染探针杂交。箭头示易位到箭头示易位到1010号染色体上号染色体上的来自的来自9 9号染色体的片段号染色体的片段2121号染色体涂染探针号染色体涂染探针FISHFISH杂交，杂交，显示显示2121三体三体比较基因组杂交（比较基因组杂交（comparative genomic comparative genomic hybridization, CGHhybridization, CGH） 近年

6、在近年在FISHFISH技术基础上发展起来的一种新的分子细胞遗技术基础上发展起来的一种新的分子细胞遗传学技术（传学技术（19921992，KallioniemiKallioniemi）。其基本原理是用不）。其基本原理是用不同荧光物质分别标记肿瘤细胞同荧光物质分别标记肿瘤细胞DNADNA和正常人细胞和正常人细胞DNADNA，然，然后与正常人中期细胞染色体杂交。后与正常人中期细胞染色体杂交。 通过检测染色体上两种荧光信号的相对比值，了解肿瘤通过检测染色体上两种荧光信号的相对比值，了解肿瘤细胞细胞DNADNA拷贝数的变化，并可在染色体上定位。拷贝数的变化，并可在染色体上定位。 这一技术已广泛这一技术

7、已广泛应用于肿瘤基因组不平衡的检测应用于肿瘤基因组不平衡的检测。比较基因组杂交的原理比较基因组杂交的原理 待测待测DNADNA（肿瘤（肿瘤细胞细胞DNADNA，test test DNA)DNA)为绿色为绿色 参照参照DNA(DNA(正常细正常细胞胞DNADNA，reference DNAreference DNA）为红色为红色 复染为蓝色复染为蓝色人食管鳞癌细胞株的比较基因组杂交人食管鳞癌细胞株的比较基因组杂交中期染色体的中期染色体的DAPIDAPI的的 复染图复染图B. 中期染色体比较基因组杂中期染色体比较基因组杂 交（交（CGHCGH）：红色区域表示）：红色区域表示 丢失，绿色区域表示扩

8、增。丢失，绿色区域表示扩增。CGHCGH的优点：的优点： 经一次染色体原位杂交实验即可在整条染色体或染色体经一次染色体原位杂交实验即可在整条染色体或染色体区带水平对待检基因组区带水平对待检基因组DNADNA序列拷贝数改变进行检测和序列拷贝数改变进行检测和定位。定位。 无需进行染色体培养，对于不易制备良好分裂相的实体无需进行染色体培养，对于不易制备良好分裂相的实体瘤尤为适用。瘤尤为适用。 所需染色体所需染色体DNADNA可来自各种组织，如新鲜组织、福尔马可来自各种组织，如新鲜组织、福尔马林固定的组织、石蜡包埋组织，可在很少量的基础上检林固定的组织、石蜡包埋组织，可在很少量的基础上检测，利于做回顾

9、性研究。测，利于做回顾性研究。CGHCGH的局限性：的局限性： 难以检出以下异常：平衡易位，微小突变，基难以检出以下异常：平衡易位，微小突变，基因重排，倍体水平改变。因重排，倍体水平改变。 结果可能受到一些因素影响：正常细胞存在，结果可能受到一些因素影响：正常细胞存在，肿瘤自身的遗传异质性，系统的波动。肿瘤自身的遗传异质性，系统的波动。 灵敏度：限于检测较大范围的缺失（灵敏度：限于检测较大范围的缺失（10 10 30MB30MB）二、突变分析与分子诊断二、突变分析与分子诊断（一）基因突变类型（一）基因突变类型点突变点突变：只有一个或几个核苷酸的改变，是突：只有一个或几个核苷酸的改变，是突变中最

10、多见的形式。变中最多见的形式。稳定突变稳定突变：传递中不改变原有的突变。：传递中不改变原有的突变。动态突变动态突变：传递中不断改变自己，多见于短重：传递中不断改变自己，多见于短重复序列的突变，在一代代传递中重复次数发生复序列的突变，在一代代传递中重复次数发生明显变化。明显变化。 点突变的结果：点突变的结果：（1 1）同义突变同义突变（samesense mutationsamesense mutation）：碱基替换后，虽）：碱基替换后，虽然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码的兼并性），亦称的兼并性），亦称静止突变静止突变。（2 2）

11、错义突变错义突变（missense mutationmissense mutation）：碱基替换，密码子）：碱基替换，密码子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨基发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨基酸。酸。 （3 3）无义突变无义突变（nonsense mutationnonsense mutation）：碱基替换后，使编）：碱基替换后，使编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。（4 4）中性突变：包含两种情况，即）中性突变：包含两种情况，即“同义突变同义突变”和不改变和不改变蛋白质功能的蛋白质功能的“错义突变错义突变”基因突变形式基因

12、突变形式碱基的插入和缺失碱基的插入和缺失 碱基碱基的的插入插入和和缺失缺失：基因编码序列中插入或丢失一个或：基因编码序列中插入或丢失一个或几个碱基，其结果是突变点下游碱基序列发生移码，编几个碱基，其结果是突变点下游碱基序列发生移码，编码氨基酸序列都发生改变，又称移码突变（码氨基酸序列都发生改变，又称移码突变（frameshift frameshift mutationmutation），），并可在突变点下游提前出现终止密码。并可在突变点下游提前出现终止密码。碱基的插入和缺失的结果碱基的插入和缺失的结果：将导致：将导致移码突变移码突变（frameshift mutationframeshift

13、mutation），），并可在突变点下游并可在突变点下游提前出现终提前出现终止密码止密码产生产生截短型蛋白截短型蛋白缺失突变缺失突变基因突变形式基因突变形式 框内突变框内突变（inframe mutationinframe mutation）：）：3 3个或是的个或是的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢失或增加失或增加1 1个或几个氨基酸。个或几个氨基酸。 DNA DNA 大片段缺失或复制大片段缺失或复制（large deletion or large deletion or duplication)duplication)：几百个：几百个bpbp

14、至几十个至几十个kbkb的碱基缺的碱基缺失或复制。失或复制。 各种类型病理性突变的比例各种类型病理性突变的比例w无义突变和移码突变：无义突变和移码突变： 6060w稀有的错义突变：稀有的错义突变： 2020wDNADNA大片段缺失或重复大片段缺失或重复: 2020w另外：可能和疾病风险评估有关的大量的多态另外：可能和疾病风险评估有关的大量的多态位点位点微小突变微小突变（二）（二）目前常用的对目前常用的对已知已知点突变的分析技术点突变的分析技术 限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLPRFLP） 等位基因特异性（等位基因特异性（PCRPCR）扩增（）扩增（ASAASA） 等位基因特异

15、性寡核苷酸杂交（等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASOASO） DNADNA芯片芯片1.1.限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLPRFLP）分析）分析 当突变影响到某一限制性内切酶位点时，当突变影响到某一限制性内切酶位点时，可通过酶切可通过酶切PCRPCR产物，电泳分析产物，电泳分析: :限制性片限制性片段长度多态性（段长度多态性（RFLPRFLP）2.2.等位基因特异性（等位基因特异性（PCRPCR）扩增（）扩增（ASAASA） 通过设计两个通过设计两个55端引物，一个与正常端引物，一个与正常DNADNA互补，互补，一个与突变一个与突变DNADNA互补。分别加入这两种引物及互补。分

16、别加入这两种引物及33端引物进行两个平行的端引物进行两个平行的PCRPCR，分析结果，分析结果。3.3.等位基因特异性寡核苷酸杂交（等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASOASO） 设计两段寡核苷酸探针，其中包含发生突变的设计两段寡核苷酸探针，其中包含发生突变的位点，位点，一段与野生型链互补一段与野生型链互补，一段与突变型链一段与突变型链互补互补。 杂交分析是否存在突变杂交分析是否存在突变4.4.基因芯片：基因芯片：SNP位点的检测位点的检测Microarray-based method for genotyping of functional single nucleotide polymorph

17、isms using dual-color fluorescence hybridization. Mutat Res. 2004; 548: 97-105（三）目前常用的（三）目前常用的未知未知基因突变分析技术基因突变分析技术 异源双链体形成分析（异源双链体形成分析（ Heteroduplex analysis, HA） 单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（Single-strand conformation analysis, SSCP） 变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 （变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 （ d e n a t u r i n g g r a d i e n t g e

18、 l electrophoresis, DGGE） 变性高效液相色谱分析（变性高效液相色谱分析（Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC ）w体外蛋白截短实验（体外蛋白截短实验（Protein truncation test, PTTPTT）w定量多重定量多重PCRPCR技术（技术（Quantitative Quantitative multiplex PCR, QM-PCR）w多重探针连接依赖性扩增技术（多重探针连接依赖性扩增技术（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifcati

19、on, MLPA) wDNADNA序列分析（序列分析（DNA sequencing)1.1.异源双链体形成分析（异源双链体形成分析（HAHA） 由突变型和野生型由突变型和野生型DNADNA链形成的异源双链链形成的异源双链DNADNA在在其错配处形成一个凸起，电泳时会产生与相应其错配处形成一个凸起，电泳时会产生与相应的同源双链的同源双链DNADNA不同的迁移率，从而使两者得以不同的迁移率，从而使两者得以分离。分离。 技术路线：技术路线：PCRPCR产物产物9595 C C变性变性5 5分钟，分钟，3737 C C复性复性 1010分钟。分钟。10%10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（0

20、.2%0.2%硝酸硝酸银染色）银染色）2.2.变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGEDGGE） 利用不同利用不同DNADNA序列开始变性时对变性剂浓度的要求序列开始变性时对变性剂浓度的要求不同，在变性剂浓度梯度凝胶内电泳，野生型不同，在变性剂浓度梯度凝胶内电泳，野生型DNADNA和突变型和突变型DNADNA序列的差异所导致其变性点不同使两序列的差异所导致其变性点不同使两者的电泳迁移率出现差异者的电泳迁移率出现差异3.3.单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（SSCPSSCP） 单链单链DNADNA在中性条件下会形成二级结构。这种二级结构在中性条件下会形成二级结构。这种二级结构依赖于其碱

21、基的序列。即使只有一个碱基的不同，也会依赖于其碱基的序列。即使只有一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构并可引起非变性条件下的电泳迁移形成不同的二级结构并可引起非变性条件下的电泳迁移率的差异。率的差异。 技术路线：技术路线：PCRPCR产物产物9595 C C变性变性5 5分钟，立即置冰上。分钟，立即置冰上。10%10%聚聚丙烯酰胺凝胶电泳。条件：电泳缓冲液丙烯酰胺凝胶电泳。条件：电泳缓冲液0.50.5 TBETBE，电压，电压70v, 470v, 4 C C环境下电泳过夜（环境下电泳过夜（0.2%0.2%硝酸银染色）。硝酸银染色）。4.4.体外蛋白截短试验（体外蛋白截短试验（PTTPTT）

22、从蛋白质水平检测基因的突变。其原理是碱基从蛋白质水平检测基因的突变。其原理是碱基缺失和插入导致的移码突变、碱基替换出现的缺失和插入导致的移码突变、碱基替换出现的无义突变均可使基因提前出现终止密码，从而无义突变均可使基因提前出现终止密码，从而截短截短mRNAmRNA翻译的蛋白质。翻译的蛋白质。 技术路线：血细胞技术路线：血细胞RNARNAcDNAcDNART-PCRRT-PCR体外体外蛋白质合成蛋白质合成电泳分析截短了的蛋白质电泳分析截短了的蛋白质相应相应基因片段的序列分析基因片段的序列分析 上游引物上游引物55端均连接端均连接T7T7启动子序列启动子序列GGATCCTAATACGACTCACT

23、ATAGGGAGACCACCATGG GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG 3535SS甲硫氨酸，甲硫氨酸，T7 T7 体外转录体外转录/ /翻译体系（兔网翻译体系（兔网织红细胞提取物），织红细胞提取物），3030孵育孵育90 min90 min，完成体，完成体外蛋白质合成。外蛋白质合成。 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.5.变性高效液相色谱分析（变性高效液相色谱分析（DHPLCDHPLC） 19951995年年Oefner and Underhill Oefner and Underhill 首次报道首次报道DHPLCDHPL

24、C技术。其原技术。其原理是在接近理是在接近DNADNA融解温度条件下进行离子对反相高效液相色融解温度条件下进行离子对反相高效液相色谱分析。谱分析。 DHPLCDHPLC分析突变的原理：分析突变的原理：在在DNADNA部分变性的条件下，变异型部分变性的条件下，变异型和野生型和野生型DNADNA可形成可形成同源双链和异源双链同源双链和异源双链根据其在层析柱根据其在层析柱上保留的时间可以分辨出变异性型上保留的时间可以分辨出变异性型DNA.DNA. 用离子对反相高效液相色谱检测用离子对反相高效液相色谱检测DNADNA变异是基于变异是基于同时存在同源双链和异源双链。异源双链的检同时存在同源双链和异源双链

25、。异源双链的检出取决于高效液相色谱的温度。而色谱温度的出取决于高效液相色谱的温度。而色谱温度的选定与野生型选定与野生型DNADNA融解温度（融解温度（TmTm）有关。）有关。 DHPLCDHPLC与其它突变分析技术的比较与其它突变分析技术的比较: : 对单个核苷对单个核苷酸变异的检出率酸变异的检出率: SSCP: SSCP技术技术, , 约约75%75%； DHPLC, DHPLC, 90%.90%.DHPLC的优点：的优点： 灵敏，准确；灵敏，准确； 分析速度快，单个样本的分析时间仅需几分分析速度快，单个样本的分析时间仅需几分钟；钟； 容易实现自动化操作；容易实现自动化操作； 适用于较大样本

26、中基因突变的筛选。适用于较大样本中基因突变的筛选。DHPLC分析：（野生型）分析：（野生型）DHPLC分析分析: : 突变型（单个碱基改变）突变型（单个碱基改变）DHPLC分析分析: : 突变型（单个碱基改变）突变型（单个碱基改变）6.6.定量多重定量多重PCRPCR技术（技术（Quantitative Quantitative multiplex PCRmultiplex PCR，Q-M-PCRQ-M-PCR） 目前各实验室普遍采用的突变基因分析技术对基目前各实验室普遍采用的突变基因分析技术对基因微小突变的检测具有较高的敏感性，如对单个因微小突变的检测具有较高的敏感性，如对单个碱基改变的检出

27、率可达碱基改变的检出率可达90%90%以上。但对于较大的以上。但对于较大的DNADNA缺失或缺失或DNADNA重复产生的突变，如以外显子为单重复产生的突变，如以外显子为单位的位的DNADNA缺失，缺失，SSCPSSCP、DHPLCDHPLC等均难以将其检出。等均难以将其检出。有资料表明大片段有资料表明大片段DNADNA缺失可占基因突变的三分之缺失可占基因突变的三分之一一定量多重定量多重PCRPCR技术要点技术要点： 涉及至少涉及至少2 2个基因的多个外显子在一个反应管内个基因的多个外显子在一个反应管内同时进行同时进行PCRPCR扩增，其中一个外显子作为参照外扩增，其中一个外显子作为参照外显子，

28、其余作为检测外显子；显子，其余作为检测外显子； 控制控制PCRPCR循环数循环数，使，使PCRPCR产物的增加处于对数增长产物的增加处于对数增长曲线内；曲线内； PCRPCR产物于产物于DNADNA测序仪电泳，其结果经测序仪电泳，其结果经GeneScanGeneScan软软件处理；件处理； 以检测外显子以检测外显子PCRPCR产物与参照外显子产物与参照外显子PCRPCR产物的产物的比值计算模版比值计算模版DNADNA相对拷贝数，确定是否存在相对拷贝数，确定是否存在检测外显子的杂合性缺失；检测外显子的杂合性缺失； 检出的缺失经其它方法（长片段检出的缺失经其它方法（长片段PCRPCR或缺失断或缺失

29、断裂点测序）确认。裂点测序）确认。7.MultiplexLigation-dependentProbeAmplifcationMLPA DenaturedgenomicDNAishybridizedwithamixtureofmorethan40probes. EachMLPAprobeconsistsoftwooligonucleotides,onesyntheticandoneM13-derived. Thetwopartofhybridizedprobesareligated. AllprobeligationproductsareamplifiedbyPCRusingonlyonepr

30、imerpair. ElectrophoresisofPCRproductsonDNASequencerinGeneScanmodel.三、遗传性疾病的诊断三、遗传性疾病的诊断遗传性疾病的诊断：遗传性疾病的诊断：（一）临症诊断（一）临症诊断（二）症状出现前的诊断（二）症状出现前的诊断（三）产前诊断（三）产前诊断（一）（一）临症诊断临症诊断 根据就诊患者的临床表现作出（初步）判断：疾病诊断，遗根据就诊患者的临床表现作出（初步）判断：疾病诊断，遗传方式传方式（1 1）症状、体征）症状、体征（2 2）系谱分析）系谱分析 部分遗传性疾病的诊断主要依赖于症状、体征部分遗传性疾病的诊断主要依赖于症状、体征

31、 对于同时存在散发病例和遗传性病例的复杂性疾病，如肿瘤，对于同时存在散发病例和遗传性病例的复杂性疾病，如肿瘤，建立相应的临床可疑病例的判定标准建立相应的临床可疑病例的判定标准 根据不同的遗传性疾病，选择适当的实验室技术分析确诊：根据不同的遗传性疾病，选择适当的实验室技术分析确诊： 生化技术、细胞技术、分子技术生化技术、细胞技术、分子技术 多用于对多用于对先证者先证者的诊断的诊断Pedigreeofafamily遗传性疾病基因诊断程序遗传性疾病基因诊断程序 临床诊断和确定分析对象临床诊断和确定分析对象 确定分析的目标基因确定分析的目标基因 以检测目标基因的结构确定分析的技术构成和分析过程：以检测目标基因的结构确定分析的技术构成和分析过程： 基因微小变异筛查：基因微小变异筛查：SSCP, DGGE, DHPLC, PTT, DNASSCP, DGGE, DHPLC, PTT, DNA测测序分析序分析 基因大片段变异（缺失或重复）的分析基因大片段变异（缺失或重复）的分析 检出变异的性质评估和患者家族的遗传咨询。检