流式细胞仪-上课-2014

1、2022-2-71流式细胞仪沈素芹沈素芹2022-2-72流式细胞仪概况工作原理及数据分析DNA分析 原理、应用、实验步骤、注意事项T淋巴细胞亚群分析 原理、应用、实验步骤、注意事项流式细胞仪的其他应用主要内容2022-2-73什么是流式细胞仪流式细胞仪实物BD-Calibur Beckman-Coulter Gallios2022-2-74BC MoFlo XDP对比 流式细胞仪是一种特殊的显微镜 流式细胞仪流式细胞仪 显微镜显微镜 流动的细胞流动的细胞 静止的细胞样本静止的细胞样本 数量大数量大 数量少数量少 高速分选高速分选 样本难以再利用样本难以再利用细胞群体特征量分布细胞群体特征量分

2、布 可以揭示细胞内部结构信息可以揭示细胞内部结构信息 流式细胞仪流式细胞仪 蛋白胶蛋白胶 多参数多参数 单参数单参数 量化的分布量化的分布 平均值平均值 容易检测各个参数间的相关性容易检测各个参数间的相关性 不容易不容易2022-2-77流式细胞仪的特点流式细胞仪的特点=单个细胞分析单个细胞分析=同时多参数分析同时多参数分析=速度快：速度快：70000个细胞个细胞/秒秒=统计学意义：提供细胞群体的统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况均值和分布情况=分选感兴趣的细胞分选感兴趣的细胞原子0.1nm 1nm10nm100nm1m10m100m1mm氨基酸蛋白质病毒支原体细菌红细胞 上皮细胞植物细

3、胞电镜光学显微镜人眼极限当前流式细胞仪可测量颗粒大小最小约0.2m 测量对象：颗粒尺度 （单细胞悬浮液）流式细胞仪的测量对象流式细胞仪的测量对象大小大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 大小范围：大小范围：0.2uM-300uM0.2uM-300uM。对象类型对象类型 细胞类型：细胞类型： （1 1）高等真核细胞；）高等真核细胞； （2 2）酵母；）酵母； （3 3）细菌；）细菌； （4 4）多细胞的聚集体，如胰岛等。）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒：非生命颗粒： 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。2022

4、-2-710细胞结构细胞结构=细胞大小细胞大小=细胞粒度细胞粒度=细胞表面面积细胞表面面积=核浆比例核浆比例=DNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNA含量含量=蛋白质含量蛋白质含量=染色体分析染色体分析 细胞功能细胞功能=细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的核的特异性抗原特异性抗原=细胞活性细胞活性=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=酶活性酶活性=激素结合位点激素结合位点=细胞受体细胞受体=细胞凋亡细胞凋亡在上述信号基础上的细胞分选在上述信号基础上的细胞分选流式细胞术的细胞学应用流式细胞术的细胞学应用2022-2-7111980.1以前： 1421980.11990.1: 94501990.1200

5、0.1: 334592000.12005.1: 288502005.12010.1: 373042010.12014.10.21: 46813美国国立生物技术信息中心美国国立生物技术信息中心 / PUBMED 查询：检索关键词：查询：检索关键词： flow cytometry 结果：结果：NCBI科技文献统计 HIV感染与病程动态监测感染与病程动态监测：辅助T淋巴细胞的绝对计数； 癌症动态及治疗方案癌症动态及治疗方案：细胞DNA含量和增殖活性； 器官移植器官移植：交叉配型； 分选人类染色体分选人类染色体，建立遗传文库（genetic libr

6、aries）； 动物育种的性别选择动物育种的性别选择：分选含x或y染色体的精子； 人类体外受精人类体外受精； 造血干细胞和其他一大类干细胞各个分化层次鉴别造血干细胞和其他一大类干细胞各个分化层次鉴别； 海洋、环境微生物研究，发现未知种属海洋、环境微生物研究，发现未知种属。几个著名的实际应用：几个著名的实际应用：2022-2-713流式细胞仪概况工作原理及数据分析DNA分析 原理、应用、实验步骤、注意事项T淋巴细胞亚群分析 原理、应用、实验步骤、注意事项流式细胞仪的其他应用主要内容+ +Surface Phenotyping+ +IntracellularHOW?2022-2-715 将待测细胞

7、染色后制成单细胞悬液。用一将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。排列，依次通过检测区域。工作原理工作原理2022-2-716 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过

8、聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下被荧光染色的细胞在激光束的照射下,产生产生散射光散射光和和激发荧光激发荧光。这两种信号分别被前向。这两种信号分别被前向光电二极管和光电二极管和90方向的光电倍增管接收。方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测；荧光信号光散射信号在前向小角度进行检测；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。同波长的荧光信号。工作原理工作原理2022-2-71

9、7=散射光信号散射光信号=荧光信号荧光信号流式细胞仪的光信号流式细胞仪的光信号2022-2-7181. 散射光信号散射光信号前向角散射光（前向角散射光（FSC,Forward ScatterFSC,Forward Scatter） 入射激光的前向散射光信号，与细胞相对大小及入射激光的前向散射光信号，与细胞相对大小及其表面积正相关其表面积正相关 ，确切地说，它与细胞直径的平，确切地说，它与细胞直径的平方值密切相关。通常在方值密切相关。通常在FCMFCM应用中，选取应用中，选取FSCFSC作阈值，作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被

10、测细胞的干扰。免对被测细胞的干扰。前向散色光前向散色光FSCFSC2022-2-7201. 散射光信号散射光信号 侧向角散射光（侧向角散射光（SSC, Side ScatterSSC, Side Scatter） 入射激光入射激光9090 角的角的散射光信号，侧向散射光对细散射光信号，侧向散射光对细 胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。与细胞粒度及细胞内精细结构和颗粒性质的信息。与细胞粒度及细胞内相对细胞内相对复杂性正相复杂性正相 关。关。侧向散色光侧向散色光SSCSSC2022-2-722外周全血细胞散射光双

11、参数点图外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）（红细胞溶解后）10 to 14 m15 to 20 m8 to 10 m2022-2-723 2 .荧光信号荧光信号=荧光素与特异抗体结合荧光素与特异抗体结合=荧光素吸收激光能量荧光素吸收激光能量=荧光素将吸收能量释放，释放较入射光波长更荧光素将吸收能量释放，释放较入射光波长更长的光量子即检测的长的光量子即检测的 发射波长发射波长=荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强号越强=有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）（阴阳）=高高FL细胞与低细胞与低

12、FL细胞区分开来（强弱）细胞区分开来（强弱）=多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量FL-AFL-HFL-W面积（面积（A A）：荧光总量）：荧光总量高度（高度（H H）：最大荧光强度）：最大荧光强度宽度（宽度（W W）：细胞直径）：细胞直径PMT：光信号到电脉冲信号高灵敏度高灵敏度50MESF50MESF 线性放大器线性放大器 对数放大器对数放大器荧光测量荧光测量流式细胞仪测定的结果百分比百分比 目标细胞占选定细胞群或所有细胞的比例目标细胞占选定细胞群或所有细胞的比例绝对浓度绝对浓度 目标细胞在样本中的浓度（目标细胞在样本中的浓度（cells/ul)荧光

13、强度荧光强度与被检测物质的表达量有关，在正态分布时与被检测物质的表达量有关，在正态分布时 一般用该值。一般用该值。变异系数变异系数 所有目标细胞表达某一个蛋白的离散程度所有目标细胞表达某一个蛋白的离散程度Histogram plotOverlay plot数据分析：流式报告中常见的几种流式细胞图数据分析：流式报告中常见的几种流式细胞图图中0 100为阴性细胞，100以上的（B）为阳性细胞 2022-2-728Contour plotDensity plotColor dot plot2022-2-729PRISM浓缩柱形图浓缩柱形图Tomogram2022-2-730细胞分类细胞分类-门的选择

14、门的选择2022-2-731流式细胞仪概况流式细胞仪的工作原理及数据分析DNA分析 原理、应用、实验步骤、注意事项T淋巴细胞亚群分析 原理、应用、实验步骤、注意事项流式细胞仪的其他应用主要内容2022-2-732G1S phaseG2MG112 1DNA含量含量 G1MG2SG0静止细胞静止细胞The Cell Cycle理论基础理论基础Propidium IodideN荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对双链DNA染色的细胞核染色试剂， PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535 nm和615 nm.DNA含量含量G1SG2M细胞数目细胞数目2022-2-735典型的细胞周期结果图典型的细

15、胞周期结果图G1SG2Example 1:Compare cyclesDay 1Day 3生物学应用生物学应用G1SG2Example 2:S phase blockT0T24G1SG2Example 3:G2 blockT0T24Fluorescent protein+DNA: Assessment of cell cycleHoechst 33342Green Fluorescent ProteinG1S G2/M2022-2-740动物细胞倍体相关基因的研究动物细胞倍体相关基因的研究2022-2-741细胞同步化的检测细胞同步化的检测植物细胞DNA倍体检测2022-2-742100101

16、102103104FL2-HMarker % GatedAll100.00M15.01M29.90M320.25M43.71肿瘤诊断肿瘤诊断DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志异倍体的出现是癌变的一个重要标志细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物学特征物学特征利用流式细胞仪进行细胞周期分析和利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。病变、肿瘤的早期诊断和肿瘤细胞学诊断。2倍体倍体异倍体异倍体4倍体倍体肿瘤组织中的各种肿瘤组织中的各种DNA倍体倍体 实验

17、步骤1. 取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培 养液吹打，养液吹打，1000rpm，离心，离心5min弃上清；弃上清；2. PBS洗洗2次，加次，加1ml吹匀，务必吹散；吹匀，务必吹散；3. 加入加入70%预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷70酒酒精），固定时可加入精），固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性）封口膜封口以增加膜的通透性）封口膜封口，4固定固定1-2h或过夜（可长至一个月）；或过夜（可长至一个月）；4. 1000rpm5min离心收集细胞，离心收集细胞

18、，PBS洗两次；洗两次；5. 用用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打；重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打；6. 加入加入Rnase-A约约3ul至终浓度至终浓度50ug/ml，37水浴消化水浴消化30min；7. 加入加入PI约约50ul至终浓度约为至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光染色，室温避光染色10min；8. 用用300目滤网过滤，上机检测。目滤网过滤，上机检测。2022-2-746R1UngatedGatedDoubletsRemoval of cell clumps注意事项注意事项2022-2-748流式细胞仪概况流式细胞仪的工作原理及数据分析DNA分析 原理、应

19、用、实验步骤、注意事项T淋巴细胞亚群分析 原理、应用、实验步骤、注意事项流式细胞仪的其他应用主要内容细胞免疫功能检测细胞免疫功能检测 T T细胞亚群、细胞亚群、 B B细胞、细胞、 NKNK细胞细胞 检测原理检测原理 不同功能的免疫细胞表面表达不同种类不同功能的免疫细胞表面表达不同种类的特征性分子的特征性分子 细胞表面分化族细胞表面分化族 ( (cluster differentiation, CD)cluster differentiation, CD)细胞表面分化族细胞表面分化族 ( (cluster differentiation, CD)cluster differentiation,

20、 CD)T T细胞表面分化族：细胞表面分化族： CD CD3 3+ + CD3+CD4+T淋巴细胞 CD3+CD8+T淋巴细胞B B细胞表面分化族细胞表面分化族: : CDCD1919+ +NKNK细胞表面分化族细胞表面分化族: : CDCD1616+ +/ CD/ CD5656+ +2022-2-751 FSC/SSC 区分淋巴细胞区分淋巴细胞2022-2-752运用运用CD3/CD19来鉴定来鉴定T淋巴细胞和淋巴细胞和B淋巴细胞淋巴细胞2022-2-753运用运用CD3/CD4来鉴定来鉴定CD4+T淋巴细胞淋巴细胞2022-2-754运用运用CD3/CD8来鉴定来鉴定CD8+T淋巴细胞淋巴

21、细胞2022-2-755运用运用CD16 +CD56/CD3-来鉴定来鉴定NK细胞细胞淋巴细胞亚群2022-2-756健康人淋巴细胞亚群正常值CD3 9552860/l 59.484.6%CD19 103 363 /l 6.422.6%CD4 4501440/L 28.560.5%CD8 3201250/L 11.138.3%CD16/56 60 360 5.630.9%CD4/CD8 0.93.62022-2-758实验步骤1.采集血液样品，取100ul抗凝全血加入每支试管中，注意不要碰到管壁。2.轻轻混匀，依次加入20ul Isotype Control(如没有的话用没染色细胞代替)，另外

22、几管加入10l荧光抗体。室温避光保存20分钟。3.加入1红细胞溶解液1ml，涡旋混匀避光保存5min，待管内液体透亮，300-500g离心5min，去上清4.加PBS 2mlPBS涡旋混匀，300-500g离心5min，弃上清，然后加0.5mlPBS摇匀。过300目尼龙网，4避光1h内上机检测； 2022-2-7592022-2-760激发光源与荧光标记物的匹配激发光源与荧光标记物的匹配荧光标记物与滤色片的匹配荧光标记物与滤色片的匹配注意事项荧光素的选择原则荧光素的选择原则弱表达抗原选择较“明亮”的荧光素细胞内抗原检测优先选择小分子荧光素多色检测时弱表达抗原放在被干扰较小的检测通道，强表达抗原

23、放在对其他通道干扰较小的检测通道表达互相排斥的抗原可以放在相互干扰较大的检测通道共表达的抗原避免放在相互干扰的通道上级抗原检测通道避免对下级抗原检测通道造成干扰2022-2-762荧光补偿荧光补偿2022-2-763Uncompensated vs Compensated2022-2-764流式细胞仪概况流式细胞仪的工作原理及数据分析DNA分析 原理、应用、实验步骤、注意事项T淋巴细胞亚群分析 原理、应用、实验步骤、注意事项流式细胞仪的其他应用主要内容2022-2-765细胞膜的变化DNA含量的变化酶活性线粒体膜电位变化侧向散射光细胞凋亡分析细胞凋亡分析Annexin-V 检测细胞凋亡检测细胞

24、凋亡 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为3536kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（PE、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对

25、凋亡中晚期的 细胞和死细胞，PI能够透过细胞 膜而使细胞核染红。因此将 Annexin V与PI匹配使用，就可以 将处于不同凋亡时期的细胞区分 开来。2022-2-7662022-2-767Annexin-V 检测细胞凋亡检测细胞凋亡正常活细胞正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞均低染；凋亡细胞Annexin V高染、高染、PI低染；坏死细胞低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染均高染2022-2-768细胞在发生凋亡时，会激活一些细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切内切酶，这些内切酶会切断核小体间的断核小体间的基因组基因组DNA。细胞凋亡时抽提。细胞

26、凋亡时抽提DNA进行电泳检测进行电泳检测，可以发现，可以发现180-200bp的的DNA ladder。基因组。基因组DNA断裂时，暴断裂时，暴露的露的3-OH可以在可以在末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，由于正常的或正在增殖的细胞显微镜或流式细胞仪进行检测，由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有几乎没有DNA的断裂，因而没有的断

27、裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。形成，很少能够被染色。这就是这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检法检测细胞凋亡的原理测细胞凋亡的原理BrdU检测细胞凋亡检测细胞凋亡2022-2-769TUNEL Assay with anti-BrdUBrdU检测细胞凋亡检测细胞凋亡DNA degradation2022-2-771Caspase-3 检测细胞凋亡检测细胞凋亡Casepase 3Casepase 3是一个凋亡相关的信号传导蛋白，以是一个凋亡相关的信号传导蛋白，以PEPE标记的抗体进行标记的抗体进行胞浆染色，可以观察表达胞浆染色，可以观察表达Caspase 3Caspase 3蛋白的细胞的比例和强度。蛋白的细胞的比例和强度。 JC-1 JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)m 的理想荧光探针。 在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。2022-2-773JC-